本文選題：結(jié)核性腦膜炎　切入點：生物標志物　出處：《重慶醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景 結(jié)核性腦膜炎（Tuberculous meningitis, TBM）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，約占結(jié)核病的7～10%，是以腦膜、大腦實質(zhì)受損為主，并可波及脊髓、脊膜的非化膿性炎癥。近年來由于人口流動頻繁、免疫抑制劑廣泛應用、耐藥性結(jié)核菌株的出現(xiàn)及人免疫缺陷病毒的流行，TBM發(fā)病率有逐漸增高的趨勢。而TBM的防治和診療過程中，早期準確的診斷與預后和治療效果緊密相關聯(lián)，因此準確有效的診斷方法在防治TBM中仍是當今亟待解決的重要醫(yī)學問題。 當前TBM的診斷主要依靠腦脊液（CSF）細胞、生化等檢查。然而在TBM發(fā)生早期，CSF細胞學、生化變化多不典型，早期TBM診斷十分困難。本實驗擬采用iTRAQ標記結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(iTRAQ—LC—MS／MS)的定量蛋白組學研究策略，，比較TBM患者和健康對照CSF蛋白質(zhì)表型，鑒定出TBM相關的差異蛋白質(zhì)，為探討TBM病理生理機制和篩選潛在診斷標志物提供新的證據(jù)。 TBM常伴有血腦屏障的破壞，這使得TBM相關的代謝分子極易從CSF擴散至外周血液，提示檢測TBM血液的代謝改變有望發(fā)現(xiàn)其潛在診斷標志物。本實驗擬采用核磁共振（NMR）的代謝組學方法，篩選出TBM的潛在血液診斷標志物。 目的 1.采用iTRAQ的定量蛋白組學技術，分析TBM和正常的腦脊液蛋白質(zhì)改變、篩選并驗證TBM的潛在CSF蛋白質(zhì)診斷標志物； 2.采用核磁共振（NMR）的代謝組學方法，比較結(jié)核性腦膜炎患者與正常對照的血漿代謝譜，篩選TBM的潛在血漿代謝診斷標志物。 方法 1.第一部分：通過iTRAQ標記蛋白組學方法，比較TBM疾病組（n=12）和正常對照(n=12)腦脊液蛋白譜，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）鑒定TBM相關的腦脊液差異蛋白，通過生物信息學分析對差異蛋白進行功能注釋和通路分析。進一步將篩選出的潛在的生物標志物蛋白進行WB驗證，并構(gòu)建診斷模型進行診斷效能評估。 2.第二部分：采用核磁共振（NMR）的代謝組學方法，比較結(jié)核性腦膜炎患者與正常對照的血漿代謝譜，篩選出結(jié)核性腦膜炎患者相對于健康對照者的血漿差異代謝物；分析差異代謝物的分子功能，初步探討這些血漿差異代謝物在結(jié)核性腦膜炎發(fā)病中的潛在作用。 結(jié)果 １．使用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學技術鑒別出81例差異蛋白質(zhì)，對這部分蛋白質(zhì)進行生物信息學分析，結(jié)果顯示這些蛋白質(zhì)的功能主要與凝血級聯(lián)反應，炎癥反應，細胞粘附密切相關。WB蛋白印跡實驗驗證結(jié)果指出NELL2水平在TBM疾病組相對于健康對照組呈現(xiàn)顯著下降。ROC曲線分析結(jié)果提示NELL2的診斷效能：83.3%的敏感性和75%的特異性。該結(jié)果提示NELL2是TBM具有良好診斷效能的潛在生物標志物。 ２．采用核磁共振（NMR）偶聯(lián)OPLS-DA的統(tǒng)計方法鑒定出TBM血漿相對于正常對照中的差異代謝物如下：有24個血漿差異代謝物質(zhì)在結(jié)核性腦膜炎組與正常組區(qū)分中起主要作用（VIP1.0）。N-乙酰糖蛋白（N-acetylglycoprotein）、丙酮酸鹽(Pyruvate)、葡萄糖（Glucose）、煙酰胺（Nicotinamide）、1-甲基組氨酸（1-Methylhistidine）、葡萄糖-內(nèi)酯（Glucono-delta-lactone）在結(jié)核性腦膜炎中的表達量增高；低密度脂蛋白（LDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）、脂質(zhì)（Lipid）、異亮氨酸（Isoleucine）、亮氨酸（Leucine）、纈氨酸（Valine）、谷氨酸（Glutamine）、蛋氨酸（Methoinine）、組氨酸（Histidine）、3-羥基丁酸酯（3-Hydroxybutyrate）、乙酸（Acetate）、丙酮(Acetone)、乙醇（Ethanol）、磷酸膽堿（PC）、甘油磷酸膽堿（GPC）、乙酰乙酸（Acetoacetate）、谷氨酰胺（Glutamate）、 N-甲基煙酰胺（N-Methylnicotinamide）在結(jié)核性腦膜炎中的表達量降低。四種生物標志物N-乙酰糖蛋白（N-acetylglycoprotein）、煙酰胺（Nicotinamide）、葡萄糖（α-Glucose，β-Glucose）經(jīng)二元Logistical Regression分析，在訓練集中可區(qū)分結(jié)核性腦膜炎患者與正常對照，AUC值為0.810。在測試集中，這四種生物標志物可區(qū)分12例結(jié)核性腦膜炎患者與13例正常對照，AUC值為0.827。在病毒性腦膜炎與結(jié)核性腦膜炎訓練集中，這四種生物標志物的AUC值為0.782。 結(jié)論 1. NELL2可作為TBM潛在的生物標志物。 2.通過TBM患者血漿的代謝組學分析，我們鑒定出TBM相關的血漿差異代謝物質(zhì)。分析這些差異代謝物質(zhì)的分子功能，并采用獨立樣本驗證相關差異代謝物的臨床診斷價值，為尋找TBM的客觀診斷方法提供了候選標志物。
[Abstract]:background
Tuberculous meningitis (Tuberculous meningitis, TBM) by Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium, tuberculosis, MTB) of central nervous system diseases caused by infection, accounting for about 7 to 10% TB, with meninges, brain parenchyma damage, and can spread to the spinal cord, spinal non suppurative inflammation. In recent years due to the floating population frequently, widely used immunosuppressant, emergence of drug-resistant strains of TB and HIV epidemic, has gradually increased the incidence rate of TBM. And the prevention and treatment of TBM in diagnosis and prognosis and treatment effect of accurate early closely related, so the medical problem diagnosis method is accurate and effective in the prevention and treatment of TBM is still an urgent.
The diagnosis of TBM mainly depends on the cerebrospinal fluid (CSF) cells, biochemical examination. However, in the early TBM, CSF cytology, biochemical changes are atypical, TBM early diagnosis is very difficult. This study combined with liquid chromatography tandem mass spectrometry using iTRAQ markers (iTRAQ - LC - MS / MS) the study strategy of quantitative protein group TBM patients and healthy controls CSF protein phenotype, identified differentially expressed proteins related to TBM, TBM to explore the pathophysiological mechanism and screening of potential diagnostic biomarkers provide new evidence.
TBM is often accompanied by the destruction of the blood-brain barrier, the metabolism of TBM related molecules easily from the diffusion of CSF to peripheral blood, prompt detection of TBM blood metabolic change is expected to find the potential diagnostic markers. This study using magnetic resonance imaging (NMR) metabonomics was screened for potential blood biomarkers in the diagnosis of TBM.
objective
1. the quantitative proteomic techniques of iTRAQ were used to analyze the protein changes in TBM and normal cerebrospinal fluid, and to screen and verify the potential diagnostic markers of the potential CSF protein of TBM.
2., we used nuclear magnetic resonance (NMR) metabonomics to compare the plasma metabolic profiles of tuberculous meningitis patients and normal controls, and screened the potential diagnostic markers of plasma metabolism of TBM.
Method
The 1. part: the first method by iTRAQ marker protein group, TBM disease group (n=12) and normal control (n=12) of cerebrospinal fluid protein, by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) identification of TBM cerebrospinal fluid is related to the difference of the protein by bioinformatics analysis and functional annotation of proteins. The potential difference pathway the biomarker protein will be further screened for WB verification, and establish the diagnostic model for the diagnostic efficacy evaluation.
The second part 2.: using magnetic resonance imaging (NMR) metabonomics approach, comparison of tuberculosis meningitis in patients with normal plasma metabolic control spectrum, screened patients with tuberculous meningitis compared with healthy controls the difference of plasma metabolites; analysis of molecular function of different metabolites, preliminary study on the potential role of plasma metabolites in the pathogenesis of these differences in tuberculous meningitis in.
Result
1. using iTRAQ quantitative proteomics technique to identify 81 cases of differential proteomics, bioinformatics analysis of the protein, the results show that these proteins function and coagulation cascade reaction, inflammatory reaction, cell adhesion is closely related to.WB blot experiment results indicate that the NELL2 level of healthy control group showed significantly decreased.ROC curve analysis showed that the diagnostic value of NELL2 in the TBM group: compared with the sensitivity of 75% and specificity of 83.3%. The results suggest that NELL2 is a potential biomarker for TBM has good diagnostic performance.
2. using nuclear magnetic resonance (NMR) statistical method of coupling OPLS-DA identified TBM plasma metabolites in difference compared to normal control as follows: there are 24 different plasma metabolites play a major role in differentiating tuberculous meningitis group and normal group (VIP1.0).N- glycoprotein (N-acetylglycoprotein), acetyl pyruvate (Pyruvate), glucose (Glucose), nicotinamide (Nicotinamide), 1- methylhistidine (1-Methylhistidine), glucose (Glucono-delta-lactone) - lactone expression in tuberculous meningitis increased; low density lipoprotein (LDL), very low density lipoprotein (VLDL), lipid (Lipid), isoleucine (Isoleucine), leucine, valine ((Leucine) Valine), glutamic acid (Glutamine), methionine (Methoinine), histidine (Histidine), 3- hydroxybutyrate (3-Hydroxybutyrate), acetic acid (Acetate), acetone (Acetone), ethanol (Ethanol), choline phosphate (PC), Glycerophosphorylcholine (GPC), acetoacetate (Acetoacetate), glutamine (Glutamate), N- (N-Methylnicotinamide) methylnicotinamide expression in tuberculous meningitis decreased. Four biomarkers of N- glycoprotein (N-acetylglycoprotein), acetyl nicotinoyl amine (Nicotinamide), glucose (-Glucose alpha, beta -Glucose) analyzed by two yuan Logistical Regression, in the training set can distinguish patients with tuberculous meningitis and normal control, AUC value of 0.810. in the test set, these four biomarkers can differentiate 12 cases of tuberculous meningitis patients and 13 cases of normal control, AUC value of 0.827. in viral meningitis and tuberculous meningitis in the training set, the four species the AUC value of 0.782. markers
conclusion
1. NELL2 can be used as a potential biomarker for TBM.
The 2. group of TBM patients by metabolic analysis, we identified the differences related to the metabolism of plasma TBM. Molecular analysis of functional metabolites of these differences, and by independent sample validation related clinical diagnostic value of different metabolites, as objective diagnostic methods for TBM has provided the candidate markers.

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R529.3

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