發(fā)布時間：2018-02-23 18:38

  本文關鍵詞： 多方棘球蚴 親肌肉蛋白 乳酸脫氫酶 免疫原性 循環(huán)核酸 檢測　出處：《青海大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:1.克隆表達多房棘球蚴親肌肉蛋白(myophilin)和乳酸脫氫酶(LDH)基因,鑒定myophilin和LDH重組蛋白的免疫原性,為基于myophilin和LDH蛋白的多房棘球蚴感染的免疫診斷研究奠定理論基礎。2.檢測泡型包蟲病患者血清中特異的多房棘球蚴miRNA和DNA分子,將其作為蟲體感染的生物標志物,為基于循環(huán)核酸的多房棘球蚴感染的檢測方法研究提供理論依據。方法:1.通過PCR技術克隆myophilin和LDH基因,將其連接入pET15b載體中,構建重組表達質粒,再轉化至E.coli Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞進行誘導表達。通過SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達形式,Ni-IDA樹脂親和層析純化重組蛋白。通過Western blotting法鑒定重組蛋白的免疫原性,ELISA法檢測泡型包蟲病患者(57例)、囊型包蟲病患者(33例)和正常人(50例)血清,初步評價重組蛋白的免疫診斷效果。通過DNAstar軟件預測重組蛋白的B、T細胞抗原表位。2.通過高通量測序技術分析泡型包蟲病患者血清miRNA表達情況,從中確定血清中特異的多房棘球蚴mi RNA分子。通過PCR技術檢測泡型包蟲病患者血清中的多房棘球蚴DNA,確定血清中特異的多房棘球蚴DNA序列。結果:1.成功克隆了myophilin和LDH基因并表達純化出相應的重組蛋白。Western blotting結果顯示,myophilin和LDH重組蛋白可被泡型和囊型包蟲病患者血清識別,而不被正常人血清識別。ELISA結果顯示,myophilin重組蛋白對泡型和囊型包蟲病患者血清的診斷敏感性分別為80.70%和78.79%;LDH重組蛋白對泡型和囊型包蟲病患者血清的診斷敏感性分別為84.21%和84.85%。DNAstar軟件預測顯示,myophilin蛋白可能有8個B細胞抗原表位,分別為15-29、41-48、72-77、110-115、130-136、145-161、169-177和181-188位氨基酸;6個T細胞抗原表位,分別為46-53、59-75、82-96、100-108、117-123和155-163位氨基酸。LDH蛋白可能有4個B細胞抗原表位,分別為52-57、81-87、97-102和221-227位氨基酸;3個T細胞抗原表位,分別為39-45、76-86和225-235位氨基酸。2.高通量測序篩選出3個可能的多房棘球蚴miRNA分子,分別為emu-miR-124a、emu-miR-87和emu-miR-9,但與人的miRBase數(shù)據庫比對顯示同源性均為100%,不具有特異性。目前使用PCR技術篩選了48對引物,尚未檢測出血清中特異的多房棘球蚴DNA序列。結論:1.多房棘球蚴myophilin和LDH重組蛋白具有較高的免疫原性,對包蟲病具有較好的免疫診斷價值。2.尚未檢測到泡型包蟲病患者血清中特異的多房棘球蚴miRNA和DNA分子。
[Abstract]:Objective to clone and express myophilin) and lactate dehydrogenase (LDH) genes from echinococcus multilocularis and to identify the immunogenicity of recombinant myophilin and LDH proteins. To lay a theoretical foundation for the immunological diagnosis of echinococcus multilocularis infection based on myophilin and LDH protein. 2. To detect the specific miRNA and DNA molecules in serum of patients with alveolar hydatid disease, and to use them as biomarkers of the infection of echinococcus multilocularis. Methods: 1. Myophilin and LDH genes were cloned by PCR technique and ligated into pET15b vector to construct recombinant expression plasmid. The recombinant protein was purified by SDS-PAGE and purified by Ni-IDA resin affinity chromatography. The immunogenicity of the recombinant protein was identified by Western blotting. The immunogenicity of the recombinant protein was detected by Elisa. There were 57 cases of disease, 33 cases of cystic hydatid disease and 50 cases of normal controls. DNAstar software was used to predict the antigen epitopes of BT cells of recombinant proteins. The expression of miRNA in serum of patients with hydatid disease was analyzed by high-throughput sequencing. PCR technique was used to detect the multilocular echinococcal DNA in the sera of patients with hydatid disease, and the specific DNA sequence of the multilocularis was determined. Results: 1. Myophilin was cloned successfully. Western blotting showed that myophilin and LDH recombinant proteins could be recognized by the sera of patients with vesicular and cystic hydatidosis. The results of Elisa showed that the sensitivity of myophilin recombinant protein to the diagnosis of vesicular and cystic hydatidosis patients was 80.70% and 78.79 respectively, and the sensitivity of the recombinant protein to diagnosis of vesicular and cystic hydatidosis was 80.70% and 78.79 respectively. The prediction of 84.21% and 84.85. DNAstar software showed that there might be 8 B cell antigen epitopes in the myophilin protein. The amino acids at the 110-115N 130-136C145-161C 169-177 and 181-188, the T cell epitopes at 46-53r-59-79-79-7108107-123 and 155-163, respectively, may have four B cell epitopes, which are 52-57-81-81-87-102 and 221-227 amino acids, respectively, and the three T cell epitopes may have four B cell epitopes, the three T cell epitopes, the three T cell epitopes, and the three T cell epitopes, the three T cell epitopes, the 3 T cell epitopes, the 3 T cell epitopes, the 3 T cell epitopes, the 3 T cell epitopes, the 3 T cell epitopes, the 3 T cell epitopes, the 3 T cell epitopes, The amino acids at position 76-86 and 225-235 of Echinococcus multilocularis were identified by high throughput sequencing. They are emu-miR-124aemu-miR-87 and emu-miR-9, respectively, but the homology with human miRBase database is 100, which is not specific. At present, 48 pairs of primers were screened by PCR technique. The specific DNA sequence of Echinococcus multilocularis has not been detected in serum. Conclusion: 1. The recombinant proteins of myophilin and LDH have high immunogenicity. The specific miRNA and DNA molecules of hydatid hydatid were not detected in the sera of patients with hydatid disease.
【學位授予單位】：青海大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R532.32

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本文編號：1527199