發(fā)布時間：2018-02-21 10:52

  本文關(guān)鍵詞： 分枝桿菌噬菌體 裂解 結(jié)核分枝桿菌 結(jié)核休眠菌 復(fù)蘇　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的 目前結(jié)核病疫情仍相當(dāng)嚴(yán)峻，化療療程過長和結(jié)核菌耐藥是當(dāng)前急待解決的兩大主要難題。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)部分分枝桿菌噬菌體能有效裂解結(jié)核菌標(biāo)準(zhǔn)株，甚至耐藥的結(jié)核菌，而雞尾酒制劑抗結(jié)核的效果更好，還能延緩結(jié)核菌對噬菌體產(chǎn)生抗性。同時也有研究發(fā)現(xiàn)尾部卷尺蛋白含motif3基序的分枝桿菌噬菌體能有效感染靜止期的恥垢分枝桿菌，且motif3具有復(fù)蘇促進(jìn)因子類似的水解肽聚糖的作用。故本實(shí)驗(yàn)首先是繼續(xù)篩選能作為分枝桿菌噬菌體雞尾酒制劑配方的噬菌體，同時也進(jìn)一步明確尾部卷尺蛋白含motif3基序的分枝桿菌噬菌體能否復(fù)蘇休眠的結(jié)核菌。 方法 1分枝桿菌噬菌體Bo4抗結(jié)核潛力研究 1.1分枝桿菌噬菌體Bo4裂解不同pH值7H9固體培養(yǎng)基上恥垢分枝桿菌mc2155能力的比較。 1.2體外研究分枝桿菌噬菌體Bo4阻止結(jié)核菌生長的能力，結(jié)果使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 2分枝桿菌噬菌體Bo4基因組生物信息學(xué)分析 2.1采用EditSeq軟件分析基因組的一般特點(diǎn)：①應(yīng)用DNAStar軟件包中Editseq分析基因組大小及GC含量。②應(yīng)用TRF軟件推測Bo4基因組中可能的串聯(lián)重復(fù)序列。③應(yīng)用tRNAscan軟件預(yù)測Bo4基因組中可能的tRNA區(qū)域。 2.2采用Glimmer3.0軟件進(jìn)行基因預(yù)測，預(yù)測分枝桿菌噬菌體Bo4的編碼區(qū)域。 2.3將分枝桿菌噬菌體Bo4核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫的核苷酸序列做Blast分析對比，并將分析對比最好的結(jié)果制作成點(diǎn)陣圖。 2.4將分枝桿菌噬菌體Bo4基因與數(shù)據(jù)庫基因進(jìn)行Blast m8比對，將比較的最好結(jié)果生成svg的共線性圖。 2.5分枝桿菌噬菌體Bo4與其他6株G簇分枝桿菌噬菌體序列兩兩比對，采用鄰接法，最后用tree view軟件生成進(jìn)化樹圖。 3分枝桿菌噬菌體TM4促使結(jié)核休眠菌復(fù)蘇的初步探索 3.1采用密閉培養(yǎng)對數(shù)生長期的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv構(gòu)建結(jié)核休眠菌模型。 3.2采用藥敏檢測、直接培養(yǎng)法和電鏡觀察作為結(jié)核休眠菌模型的檢測方法。 3.3采用雙層固體培養(yǎng)基法擴(kuò)增分枝桿菌噬菌體TM4及采用小平板法測定噬菌體TM4滴度。 3.3采用肉眼觀察、菌落計(jì)數(shù)和電鏡觀察作為結(jié)核休眠菌復(fù)蘇的檢測指標(biāo)。 結(jié)果 1分枝桿菌噬菌體Bo4抗結(jié)核潛力研究 1.1分枝桿菌噬菌體Bo4裂解不同pH值7H9固體培養(yǎng)基上恥垢分枝桿菌mc2155能力的比較。 1.2分枝桿菌噬菌體Bo4感染組與空白對照組比較，，在分別培養(yǎng)1天、3天及5天后，兩組結(jié)核菌量均有明顯差異，說明分枝桿菌噬菌體Bo4能有效裂解結(jié)核菌，阻止其生長。 2分枝桿菌噬菌體Bo4基因組生物信息學(xué)分析 2.1分枝桿菌噬菌體Bo4基因組大小為39318bp，GC含量為66.76%。通過TRF軟件在噬菌體Bo4基因組中未找到串聯(lián)重復(fù)序列。通過tRNAscan軟件在噬菌體Bo4基因組中未找到tRNA。 2.2根據(jù)Glimmer3.0軟件分析，共預(yù)測出58個推測基因，對這些基因逐個進(jìn)行同源檢索分析，得到19個已知功能的基因，35個基因與未知功能的基因有同源性，4個基因未找到同源性基因。通過生物學(xué)信息分析在分枝桿菌噬菌體Bo4基因組中未發(fā)現(xiàn)有毒基因。 2.3分枝桿菌噬菌體Bo4基因組的58個基因中只有4個基因與BPs和Angel無同源性，相似度達(dá)93.10%，共線性清晰，所以我們推測Bo4屬于G簇分枝桿菌噬菌體，并且基因組是雙鏈線性DNA。 2.4分枝桿菌噬菌體Bo4核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫核苷酸序列比較分析發(fā)現(xiàn)，其與目前已經(jīng)測序的6株G簇分枝桿菌噬菌體核苷酸序列相似性均較高（平均相似性90%），也證明分枝桿菌噬菌體Bo4屬于G簇分枝桿菌噬菌體。 2.5從系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知距離越近的噬菌體，親緣關(guān)系越近。分枝桿菌噬菌體Bo4與其他6株G簇分枝桿菌噬菌體核苷酸相似性均較高，系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其與分枝桿菌噬菌體Legendre的關(guān)系最近。說明這兩株分枝桿菌噬菌體具有共同的祖先。 3分枝桿菌噬菌體TM4促使結(jié)核休眠菌復(fù)蘇的初步探索 3.1結(jié)核休眠菌模型的構(gòu)建及檢測 密閉培養(yǎng)18天的含亞甲藍(lán)的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv試管變?yōu)闊o色，說明此時試管已變?yōu)槿毖�。密閉培養(yǎng)50天還有部分結(jié)核菌可培養(yǎng)，未完全進(jìn)入休眠菌狀態(tài)。密閉培養(yǎng)93天的模型液接種在羅培養(yǎng)基上無菌落生長。將對數(shù)生長期的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和密閉培養(yǎng)120天的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv行電鏡觀察，見密閉培養(yǎng)120天的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的細(xì)胞壁比對數(shù)生長期的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的細(xì)胞壁厚，交聯(lián)更緊密。 3.2噬菌體液的制備 按照雙層固體培養(yǎng)法擴(kuò)增分枝桿菌噬菌體TM4，直接刮取上層培養(yǎng)基收集噬菌體液及采用小平板法測噬菌體TM4滴度，測定為2.1×1010PFU/mL。 3.3復(fù)蘇休眠菌 3.3.1肉眼觀察培養(yǎng)3天Rpf E組管底菌量多于其余組；培養(yǎng)8天噬菌體TM4組管底菌量多余空白組；后續(xù)觀察見TM4組及Rpf E組管底菌量較前均有增加，培養(yǎng)上清液明顯變黃，空白組與之前比較也稍有增加。 3.3.2混合液培養(yǎng)1天時三組菌落計(jì)數(shù)均是0CFU/m；培養(yǎng)6天時，空白組、TM4組和Rpf E組的菌落計(jì)數(shù)分別是0CFU/mL、0.7×102CFU/mL和2×104CFU/mL；培養(yǎng)14天時，空白組、TM4組和Rpf E組的菌落計(jì)數(shù)分別是3.4×101CFU/mL、1.68×107CFU/mL和2.1×109CFU/mL。 3.3.3電鏡觀察培養(yǎng)17天混合物TM4組有大量薄壁結(jié)核菌、部分厚壁且交聯(lián)緊密的結(jié)核休眠菌和結(jié)核菌細(xì)胞碎片；Rpf E組滿視野薄壁的結(jié)核菌；空白組含大量厚壁的結(jié)核休眠菌和少數(shù)薄壁結(jié)核菌。 結(jié)論 分枝桿菌噬菌體Bo4能有效阻止體外結(jié)核菌的生長，基因組生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其是一株不含有毒基因的裂解性噬菌體，滿足作為分枝桿菌噬菌體雞尾酒制劑配方噬菌體的安全性要求。分枝桿菌噬菌體TM4能有效感染結(jié)核菌，并且在復(fù)蘇結(jié)核休眠菌的同時隨著成熟子代噬菌體的釋放，會裂解被感染的結(jié)核休眠菌細(xì)胞。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R52

【參考文獻(xiàn)】

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2 彭麗;陳保文;羅永艾;沈小兵;黎友倫;蘇城;王國治;;噬菌體D29對耐藥結(jié)核病豚鼠的治療作用[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年17期

3 佴靜;朱雪薇;劉忠泉;;復(fù)蘇因子促進(jìn)休眠結(jié)核桿菌復(fù)蘇作用的研究[J];中國醫(yī)學(xué)工程;2008年02期

4 彭麗;羅永艾;陳保文;黎友倫;沈小兵;蘇城;王國治;;噬菌體D29對感染敏感株結(jié)核分枝桿菌豚鼠的療效[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2009年08期

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2 劉平;分枝桿菌噬菌體的生物學(xué)特性及基因組學(xué)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號：1521782