本文關(guān)鍵詞： 鼠疫耶爾森氏菌 aspA基因 生存能力 毒力 適應(yīng)度　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis,以下簡稱鼠疫菌)引起的一種暴發(fā)性的烈性傳染病。人類跟鼠疫之間存在一個長期的斗爭過程,到目前為止,鼠疫仍然是公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一個重大的威脅,每年國際上都會出現(xiàn)疫情暴發(fā)并致人死亡。傳統(tǒng)的微生物學(xué)、基因組學(xué)以及細菌群體遺傳學(xué)都表明鼠疫菌是在約2600-5000年前由假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis,簡稱假結(jié)核菌)進化而來。由于遺傳分化時間非常短暫,鼠疫菌跟其祖先菌株假結(jié)核菌同時存在,我們能夠通過比較基因組學(xué)和功能基因組學(xué)實驗的方式來研究鼠疫菌這種致命的病原菌是如何進化而來的。假結(jié)核菌是一種腸道病原菌,其可以在土壤環(huán)境或者水環(huán)境等自然環(huán)境中長時間生存,僅會引起慢性腸道疾病。與假結(jié)核菌不同,鼠疫菌具有更強的侵襲能力和致病能力,但其通常只能在哺乳動物和跳蚤之間的狹小宿主范圍內(nèi)傳遞。鼠疫菌和假結(jié)核菌在傳播途徑、致病能力和生存環(huán)境上存在著巨大的差異,而二者90%以上的基因都是相同或者幾乎相同的。鼠疫菌和假結(jié)核菌的基因組比較結(jié)果顯示,鼠疫菌獲得了兩個外源性的質(zhì)粒(p MT1和p PCP1),同時約有13%的假結(jié)核菌基因在鼠疫菌中失去了活性。在這些失活基因中,編碼天門冬氨酸酶的asp A基因是很獨特的。天門冬氨酸酶(Asp A)催化一個可逆反應(yīng)(天門冬氨酸生成延胡索酸并釋放一個氨基)。我們前期對于鼠疫菌基因組的研究發(fā)現(xiàn),asp A基因第363位密碼子是鼠疫菌進化中的一個突變熱點。為了進一步檢驗asp A基因第363位密碼子的多樣性,我們對來自我國14個不同疫源地不同分離時間(1943年至2005年期間)的819株鼠疫菌進行了asp A基因測序,確定了asp A基因第363位密碼子至少9種等位基因型的存在。進一步的信息學(xué)分析顯示這些突變并不是進化譜系(lineage)特異性的,而且同一種突變在鼠疫菌的進化過程中多次出現(xiàn)。鼠疫菌asp A基因第363位密碼子的高突變頻率以及這些等位基因型的趨同進化表明,該密碼子的突變可能是經(jīng)過多樣化的正向選擇壓力篩選形成的。在典型鼠疫菌群體中,asp A基因第363位密碼子的主要等位基因型是TTG,其編碼的天門冬氨酸酶功能失活。但是在假結(jié)核菌和一些古老的鼠疫菌中,asp A基因第363位密碼子是GTG,其編碼了一個功能正常的天門冬氨酸酶。根據(jù)上述的結(jié)果我們提出假設(shè),asp A基因第363位密碼子的高頻率突變是趨向于恢復(fù)鼠疫菌中天門冬氨酸酶的活性。為了驗證這一推論,我們需要在鼠疫菌asp A基因的第363位密碼子處引入不同的突變并通過實驗驗證這些突變對鼠疫菌生存和繁殖帶來的影響。鼠疫菌201菌株根據(jù)鼠疫菌的生物型分類,屬于田鼠型菌株,其asp A基因第363位密碼子為GTG,與假結(jié)核菌中的asp A基因一致,其編碼的天門冬氨酸酶是有活性的。我們基于λ-Red重組系統(tǒng)在鼠疫菌中建立了一個無痕突變技術(shù)平臺,并成功構(gòu)建了兩株鼠疫菌201菌株asp A基因第363位密碼子突變株,其中一株將asp A基因第363位密碼子由GTG突變?yōu)門TG(201-asp ATTG),導(dǎo)致了其編碼天門冬氨酸酶的失活;另一株將密碼子由GTG突變?yōu)門TT(201-asp ATTT),其編碼天門冬氨酸酶活性降低至野生型10%左右。隨后我們比較了鼠疫菌201野生株和突變株之間的表型差異。經(jīng)過實驗我們發(fā)現(xiàn),asp A基因第363位密碼子的突變對201株的生長和抵抗外界環(huán)境脅迫能力造成了明顯的影響。與201野生株和突變株201-asp ATTT相比,突變株201-asp ATTG在豐富培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)或者營養(yǎng)缺乏培養(yǎng)基(TMH培養(yǎng)基)中的生長均存在一定程度的遲滯。當(dāng)去除掉TMH培養(yǎng)基中的L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺等Asp A代謝相關(guān)的氨基酸后,201菌株野生株和突變株201-asp ATTT以及201-asp ATTG的生長狀態(tài)趨于一致,證明這種生長差距確實是由asp A基因的突變引起的。進一步的抗外界環(huán)境脅迫能力實驗顯示,201野生株和突變株201-asp ATTT的抗氧化能力和耐酸能力均要優(yōu)于突變株201-asp ATTG。這些體外模擬刺激條件都與巨噬細胞內(nèi)的微環(huán)境吻合,提示我們asp A基因的多樣性可能與鼠疫菌在巨噬細胞內(nèi)的存活和增殖能力相關(guān)聯(lián)。進一步的實驗結(jié)果證實了這個猜想:與201菌株野生株相比,突變株201-asp ATTT和201-asp ATTG的抗吞噬能力沒有差異,但是二者在RAW264.7巨噬細胞中的生存和增殖能力均出現(xiàn)了缺陷。而鼠疫菌在巨噬細胞內(nèi)的存活和增殖能力,對于鼠疫菌早期感染是至關(guān)重要的。為了比較201野生株和兩株突變株之間的毒力差異,我們用BALB/c小鼠進行了腹股溝皮下注射攻毒,繪制了小鼠生存曲線,并測量了突變株對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)。結(jié)果顯示,突變株201-asp ATTT和201-asp ATTG均出現(xiàn)了不同程度的減毒,突變株201-asp ATTT對BALB/c小鼠的半數(shù)致死量為5.75×105CFU,突變株201-asp ATTG的減毒程度更高,3.69×106CFU的攻毒劑量都無法造成小鼠的死亡,而201野生株對BALB/c小鼠的半數(shù)致死量小于10CFU。這一系列毒力實驗結(jié)果提示我們,asp A基因第363位密碼子的突變與鼠疫菌的毒力有著密切的關(guān)系。最后我們進行了一個體外培養(yǎng)競爭實驗,將201菌株野生株和突變株201-asp ATTG按照一定的比例混合后,在豐富培養(yǎng)基(LB)中共培養(yǎng),隨后提取混合DNA并對Asp A基因進行擴增測序。通過高通量測序分析,我們發(fā)現(xiàn)201菌株野生株(Asp A有活性)能夠在生長的過程中很快的超越突變株201-asp ATTG(Asp A失活),在群體中占據(jù)優(yōu)勢地位。這一結(jié)果說明在鼠疫菌中,含有asp A活性基因的菌株具有適應(yīng)度優(yōu)勢,asp A基因第363位密碼子承受了正選擇壓力而趨于恢復(fù)典型鼠疫菌中失活asp A基因的活性。我們的實驗結(jié)果表明,細菌中特定基因的單一密碼子也可以成為自然選擇的作用對象。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R516.8

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