本文關(guān)鍵詞： 非酒精性脂肪性肝病 病毒性肝炎 鼠3型肝炎病毒 肝臟免疫損傷　出處：《華中科技大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[背景及目的] 非酒精性脂肪性肝病(Non-alcholic fatty liver disease, NAFLD)是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn),包括單純性脂肪肝(simple steatosis),非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcholic steatohepatitis, NASH),以及NASH相關(guān)的肝纖維化/肝硬化、肝癌。隨著生活水平的提高,NAFLD在發(fā)展中國家的發(fā)病率顯著上升,我國NAFLD患者數(shù)量在過去的10年增加了近一倍,部分地區(qū)的發(fā)病率已達四分之一。同時,我國是病毒性肝炎感染的高發(fā)地區(qū),約有1億HBV感染者及4000萬HCV感染者,其中合并NAFLD的患者有逐年增加的趨勢,這一部分人群已經(jīng)引起了研究者們的注意。 目前關(guān)于NAFLD合并病毒性肝炎的研究多集中在NAFLD合并慢性丙型肝炎(Chronic hepatitis C,CHC):NAFLD可以增加CHC患者進展為肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的風(fēng)險,并降低抗病毒治療的療效。但是,丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)本身具有致肝細胞脂肪變的作用,因此在NAFLD合并CHC患者中得到的結(jié)論可能并不能推而廣之。關(guān)于NAFLD對慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)的影響,目前的研究結(jié)果卻并不一致,與CHC中看到的現(xiàn)象也不相同。部分研究認為,肝臟脂肪變對CHB具有保護作用：在脂肪肝患者中,乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)載量更低,乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)清除率更高。但另一方面,一些研究顯示,脂肪肝可能會增加CHB患者發(fā)展為肝硬化及HCC的風(fēng)險,降低恩替卡韋抗病毒治療的效果。還有一些研究認為,脂肪肝對HBV病毒載量及干擾素抗病毒治療無影響。事實上,這方面的研究存在許多難點,可能是導(dǎo)致這些矛盾結(jié)論的原因。首先,研究中多用肝臟超聲診斷脂肪肝。肝臟超聲檢查僅能檢出肝內(nèi)脂肪沉積超過30%的中度脂肪肝,難以檢出輕度脂肪肝(肝臟內(nèi)脂肪沉積為5%-30%),因此在分組時,可能將輕度脂肪肝患者作為無脂肪肝的對照。其次,在研究NAFLD合并CHB時,難以保證受試者在代謝、病毒、治療等多種因素上的一致性。第三,人群研究難以獲取肝組織觀察肝內(nèi)免疫、代謝等方面的改變。因此,NAFLD在慢性病毒性肝炎中的影響仍不明確。 動物模型可以克服上述臨床研究中的不足,但目前尚缺乏NAFLD合并病毒性肝炎的動物模型。為了更好的研究NAFLD對慢性病毒性肝炎的影響,本研究的具體研究目標如下： 1.成功建立飲食誘導(dǎo)的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型； 2.在飲食誘導(dǎo)的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型中,動態(tài)觀察肝炎病毒的復(fù)制情況及肝組織損傷程度； 3.探討NAFLD影響病毒性肝炎病程的相關(guān)免疫學(xué)機制。 [方法] 1.采用60%高脂飲食(High fatty diet, HFD)喂養(yǎng)C3H/HeN小鼠12周,觀察小鼠一般狀態(tài)及生活習(xí)性改變,觀察體重、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、總膽固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)、血糖(Glucose,GLU)、胰島素水平及穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis Model Assessment-Insulin Resistance, HOMA-IR)的動態(tài)變化及肝臟組織學(xué)變化。 2.3型鼠肝炎病毒(Murine hepatitis virus-3,MHV-3)腹腔注射感染NAFLD小鼠,觀察小鼠一般狀態(tài)及生存率；動態(tài)觀察小鼠感染后血清生化學(xué)變化及肝臟病理改變；逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測小鼠肝內(nèi)MHV-3。 3.MHV-3腹腔感染NAFLD小鼠及正常飲食(Normal diet, ND)小鼠,比較兩組小鼠生存率；比較兩組小鼠各時間點血清生化學(xué)變化及肝組織病理改變；實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)檢測并比較各時間點兩組小鼠肝內(nèi)MHV-3復(fù)制情況。 4.流式細胞術(shù)檢測MHV-3感染后各時間點小鼠肝內(nèi)CD3+CD8+CD69+T細胞、CD3+CD8+PD-1+T細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例的變化,并比較兩組小鼠之間的差異；Real-time PCR檢測并比較兩組小鼠MHV-3感染后各時間點肝內(nèi)IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-22、IL-33、TNF-α、Fg12的表達,并比較兩組小鼠之間的差異。 [結(jié)果] 1.成功建立NAFLD小鼠模型。HFD飲食喂養(yǎng)12周,C3H/HeN小鼠體型肥胖,皮毛油膩,不喜活動,體重明顯增加；外周血ALT及AST水平無顯著升高；TG、TC、HDL、LDL、GLU、胰島素水平及HOMA-IR均顯著升高；小鼠肝臟體積增大,肝重高于ND組,邊緣圓鈍,色澤紅黃,表面光滑,有油膩感；肝組織切片HE染色及油紅O染色可見肝細胞內(nèi)大量脂滴形成。 2.成功建立飲食誘導(dǎo)的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型。NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后,在3-12天內(nèi)出現(xiàn)死亡,死亡率約為20%；感染小鼠外周血ALT和AST水平顯著升高；感染小鼠肝臟蒼白,缺乏光澤,并可見彌漫分布的針尖樣出血點；HE染色除可見肝細胞內(nèi)脂滴形成,還可見肝細胞胞漿疏松、肝細胞壞死、淋巴細胞浸潤等表現(xiàn)；PCR可檢測到肝內(nèi)MHV-3病毒復(fù)制。 3. NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后,生存率與對照組無差異；MHV-3病毒復(fù)制高于對照組,于感染4天時有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.002); ALT及AST升高幅度大于ND組；肝組織炎癥壞死程度交對照組嚴重。 4. NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后,肝內(nèi)IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-33、TNF-α、Fg12表達水平上調(diào),且上調(diào)幅度大于ND組小鼠,而IL-22表達水平降低,且降低幅度大于對照組小鼠。 5. NAFLD小鼠感染MHV-3病毒后,肝內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例降低,但感染第16天開始高于ND組小鼠；CD3+CD8+CD69+T及CD3+CD8+PD1+T細胞均出現(xiàn)升高,上升幅度大于ND組小鼠,且細胞比例回落后仍持續(xù)高于ND組小鼠。 [結(jié)論] 1.本研究采用HFD喂養(yǎng)C3H/HeN小鼠12周成功建立NAFLD小鼠模型,并在此基礎(chǔ)上采用MHV-3病毒腹腔感染小鼠,成功建立NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型。為研究NAFLD對病毒性肝炎的影響提供了動物模型,開辟了新的研究途徑。 2. NAFLD可以加劇肝內(nèi)MHV-3病毒復(fù)制,加重肝內(nèi)炎癥反應(yīng)。 3. NAFLD在病毒性肝炎感染早期可以促進肝內(nèi)細胞因子的釋放,使CD3+CD8+CD69+T比例增加,CD4+CD25+Foxp3+Treg比例降低,可導(dǎo)致肝內(nèi)炎癥壞死加重的。而感染后期CD4+CD25+Foxp3+Treg及CD3+CD8+PD1+T細胞比例的增加,有可能阻礙病毒清除。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575.5;R512.6

【共引文獻】

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本文編號：1508617