本文關(guān)鍵詞： 肝炎乙型慢性 自然殺傷細(xì)胞 NK細(xì)胞凝集素樣受體亞家族KNKG2D/CD314） 干擾素γ誘導(dǎo)蛋白-10 kD（IP-10） 細(xì)胞毒性免疫　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是當(dāng)前嚴(yán)重社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球約20億人曾感染過(guò)HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者，每年大約100萬(wàn)人死于HBV感染相關(guān)終末期肝病，因而成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)界關(guān)注焦點(diǎn)之一。我國(guó)2006年HBV感染血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，1~59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18%，據(jù)此推算我國(guó)現(xiàn)有慢性HBV感染者約9300萬(wàn)例，慢性乙型肝炎（chronichepatitis B，CHB）患者約2000萬(wàn)例，其中15%~40%將可能死于肝衰竭、失代償期肝硬化和原發(fā)性肝癌等終末期肝病，嚴(yán)重威脅國(guó)民的健康。CHB發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚存在諸多問(wèn)題有待深入。近年來(lái)，隨著對(duì)CHB免疫機(jī)制認(rèn)識(shí)深入，國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為：HBV病毒本身并非造成肝細(xì)胞損害的首要原因，而病毒感染細(xì)胞誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的一系列免疫清除反應(yīng)才是造成CHB病理?yè)p傷的核心環(huán)節(jié)。因此，宿主免疫狀態(tài)是影響HBV感染后疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵因素之一，有效調(diào)節(jié)宿主免疫功能，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)HBV感染肝細(xì)胞的特異性識(shí)別，抑制甚或清除HBV并實(shí)現(xiàn)持久的免疫控制成為目前實(shí)現(xiàn)CHB理想治療目標(biāo)的重要策略。 傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）通過(guò)特異性殺傷機(jī)制在誘發(fā)組織免疫病理?yè)p傷、特異性清除HBV環(huán)節(jié)占據(jù)主導(dǎo)地位，但近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)以自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NKcells）、NKT細(xì)胞為首的非特異性免疫反應(yīng)在防御甚至清除HBV感染過(guò)程中亦發(fā)揮重要作用。尤其當(dāng)HBV特異性CTL不足以清除病毒情況下，肝臟招募大量NK細(xì)胞向肝內(nèi)聚集、活化。在這一過(guò)程中：CXC家族趨化因子干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白-10（interferon gamma inducible protein10kD，IP-10）作為肝臟募集NK細(xì)胞關(guān)鍵趨化因子，必然對(duì)NK細(xì)胞在器官、組織中重分布，以及NK細(xì)胞所介導(dǎo)的抗病毒免疫應(yīng)答發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用；另一方面，以NKG2D為代表的NK細(xì)胞膜受體活化在介導(dǎo)突破HBV感染后免疫耐受、啟動(dòng)非特異性和/或特異性免疫清除等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。因此，研究HBV感染者肝內(nèi)NK細(xì)胞募集、活化的機(jī)制及其信號(hào)通路，對(duì)明確HBV感染后慢性化/重癥化機(jī)制，探尋抗HBV免疫調(diào)控靶點(diǎn)、強(qiáng)化免疫調(diào)節(jié)療效等均具有重要現(xiàn)實(shí)意義。 目的：通過(guò)檢測(cè)慢性HBV攜帶者（chronic HBV carriers，AsC）、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）和HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭（HBVrelated acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF）患者外周血、肝組織中NK細(xì)胞數(shù)量、活性；NK細(xì)胞膜受體NKG2D及胞內(nèi)IFN-γ陽(yáng)性表達(dá)；血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NK細(xì)胞效應(yīng)分子IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B表達(dá)，以及NK細(xì)胞趨化因子IP-10表達(dá)及其與肝組織炎癥損傷、NK細(xì)胞聚集、HBV復(fù)制的關(guān)系等，探討慢性HBV感染不同臨床階段NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫差異，證實(shí)NK細(xì)胞在介導(dǎo)慢性HBV感染者免疫活化、病理?yè)p傷、肝炎重癥化等方面的作用與機(jī)制。另一方面，通過(guò)對(duì)臨床聚乙二醇干擾素α（pegylated interferon alpha，Peg IFN-α）抗病毒治療CHB患者的隊(duì)列研究，觀察NK細(xì)胞活化、IP-10基線表達(dá)與動(dòng)態(tài)變化等對(duì)抗病毒治療應(yīng)答的影響，初步評(píng)估NK細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)對(duì)干擾素抗病毒治療應(yīng)答的預(yù)測(cè)價(jià)值，并結(jié)合Peg IFN-α聯(lián)合阿德福韋酯（adefovir dipivoxil，ADV）抗病毒治療臨床療效觀察，為CHB患者探求免疫調(diào)控靶點(diǎn)及臨床優(yōu)化抗病毒策略提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 方法： 1NKG2D介導(dǎo)NK細(xì)胞活化對(duì)慢性HBV感染者免疫激活及重癥化影響 依據(jù)我國(guó)2010年《慢性乙型肝炎防治指南》、2006年《肝衰竭診療指南》診斷、分型標(biāo)準(zhǔn)，入選AsC、CHB、HBV-ACLF患者各15例，同期篩選15例健康獻(xiàn)血員作為健康對(duì)照組（healthy controls，HC）。所有納患者入組前6月均未曾接受過(guò)免疫調(diào)節(jié)、抗病毒及乙肝疫苗治療；排除HAV、HCV、HEV、EBV、CMV、HIV等合并感染；無(wú)合并酒精、藥物、代謝性、免疫性肝病及惡性腫瘤等。全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清白蛋白（albumin，Alb）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）等；酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B水平；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）檢測(cè)血清HBV DNA載量；電化學(xué)發(fā)光法（electrochemiluminescence，ECL）定量檢測(cè)HBsAg、HBeAg滴度。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)NK（CD3 CD56+）細(xì)胞、NKG2D+NK細(xì)胞頻率，胞內(nèi)因子染色法檢測(cè)IFN-γ+NK細(xì)胞頻率。肝組織標(biāo)本蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，觀察炎癥、壞死程度；免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色觀察NK（CD3 CD57+）細(xì)胞分布、數(shù)量，NKG2D+、IFN-γ+細(xì)胞表達(dá)；Real time PCR檢測(cè)NKG2D、IFN-γ mRNA表達(dá)。 2NKG2D信號(hào)通路在TNF-α誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化殺傷HBV復(fù)制靶細(xì)胞機(jī)制中的作用 復(fù)蘇HepG2細(xì)胞以含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的HG-DMEM培養(yǎng)基于5%CO2，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于六孔板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，至60%~70%細(xì)胞融合時(shí)更換新鮮完全培養(yǎng)基，以VigoFect高效轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，24h后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞（HBV-HepG2細(xì)胞），傳代培養(yǎng)，收集細(xì)胞上清液Real-time PCR測(cè)定HBV DNA載量，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，并篩選HBV DNA≥5.0×106拷貝/ml細(xì)胞進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同期復(fù)蘇NK-92細(xì)胞，以含12.5%胎牛血清、12.5%馬血清、200IU/ml IL-2、0.5ng/mlIL-15的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)、傳代，MTT法驗(yàn)證NK-92細(xì)胞殺傷活性，而后分組干預(yù)：?jiǎn)渭?xì)胞培養(yǎng)組、單細(xì)胞培養(yǎng)干預(yù)組、聯(lián)合培養(yǎng)組、聯(lián)合培養(yǎng)干預(yù)組。經(jīng)24h處理后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清液。ELISA檢測(cè)上清液中TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B水平，Real-time PCR定量檢測(cè)HBV DNA載量。 3干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白-10募集NK細(xì)胞肝臟遷移對(duì)CHB抗病毒應(yīng)答影響 橫斷面研究：病例篩選，血清ALT水平、HBV DNA載量，PBMCs中NK細(xì)胞頻率、肝組織炎癥活動(dòng)度（inflammation activity，IA）積分等同第一部分。另外，ELISA法檢測(cè)血清IFN-γ及其誘導(dǎo)蛋白-10（interferongamma inducible protein10kD，IP-10）水平；IHC染色觀察肝組織IFN-γ、IP-10陽(yáng)性表達(dá)；Real time PCR檢測(cè)肝組織IFN-γ、IP-10mRNA表達(dá)。 隊(duì)列研究：納入2010年1月~2011年12月接受Peg IFN α抗病毒治療CHB患者60例，入選病例符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)滿足下列條件：18~65歲；HBV DNA≥104拷貝/ml；80U/L ALT 400U/L，和/或經(jīng)肝組織病理證實(shí)炎癥分級(jí)≥G2；6個(gè)月內(nèi)未曾接受過(guò)抗病毒、免疫調(diào)節(jié)劑及乙肝疫苗治療。排除妊娠及哺乳期女性，無(wú)HAV、HCV、HEV或HIV合并感染，無(wú)惡性腫瘤、自身免疫性疾病、未控制的糖尿病、甲狀腺疾病，既往精神病史，或其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病、干擾素用藥禁忌等情況。收集患者抗病毒治療前、治療中、停藥隨訪期血清，用于ALT、AST、HBV DNA、HBsAg、HBeAg及細(xì)胞因子IFN-γ、IP-10動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；收集部分患者治療前、后肝穿刺組織標(biāo)本，進(jìn)行組織病理及分子生物學(xué)檢測(cè)（檢測(cè)指標(biāo)及方法同橫斷面研究）。 4Peg IFN-α2a聯(lián)合ADV個(gè)體化治療提高HBeAg陽(yáng)性CHB患者抗病毒療效 本隊(duì)列研究納入符合干擾素抗病毒治療HBeAg陽(yáng)性CHB患者160例（納入與排除標(biāo)準(zhǔn)同前）。所有患者1：1比例隨機(jī)分配進(jìn)入干擾素標(biāo)準(zhǔn)治療組和個(gè)體化治療組。標(biāo)準(zhǔn)治療組患者接受Peg IFN α-2a標(biāo)準(zhǔn)治療，個(gè)體化治療組又依據(jù)患者基線HBV DNA載量和/或肝纖維化程度亞分為初始Peg IFN α-2a與ADV聯(lián)合治療組（38例，HBV1.0×107copies/ml和/或肝纖維化≥S3）和初始Peg IFN α-2a單藥治療組（42例）。治療24周后，對(duì)個(gè)體化治療組療效初評(píng)，并依據(jù)抗病毒應(yīng)答重新分組：對(duì)HBV DNA低于檢測(cè)下限、HBeAg清除及ALT復(fù)�；颊撸^續(xù)（或調(diào)整為）Peg IFN α-2a單藥治療，余者均繼續(xù)（或調(diào)整為）Peg IFN α-2a聯(lián)合ADV治療至療程結(jié)束。所有患者均接受至少48周抗病毒治療，并隨訪至96周，常規(guī)檢測(cè)生化學(xué)、病毒學(xué)、血清學(xué)等指標(biāo)及血常規(guī)、肝腎功能、甲狀腺功能等，動(dòng)態(tài)觀察患者抗病毒治療療效、安全性、耐藥率及停藥復(fù)發(fā)率等。 結(jié)果: 1NKG2D介導(dǎo)NK細(xì)胞活化對(duì)慢性HBV感染者免疫激活及重癥化影響 1.1人口基線特征與血清指標(biāo)特點(diǎn)： 各組患者在年齡構(gòu)成、性別比例具有可比性。HBV-ACLF患者血清ALT、TBil水平均顯著高于、PTA水平顯著低于CHB及AsC患者（均P0.01）。與CHB患者相比，HBV-ACLF患者HBV DNA載量、HBeAg滴度偏低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01或0.05）。 1.2血清IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B水平變化： HBV-ACLF組患者血清IFN-γ（10.78±1.19pg/ml）、TNF-α（118.25±25.36pg/ml）水平均顯著高于CHB組（6.98±1.12pg/ml；69.54±17.35pg/ml）、AsC組（2.24±0.45pg/ml；26.25±6.37pg/ml），兩兩比較各組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.01）。各組血清IFN-γ、TNF-α水平以健康對(duì)照組（1.98±0.58pg/ml；24.58±6.15pg/ml）最低，但與AsC組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 血清穿孔素、顆粒酶B變化趨勢(shì)與IFN-γ一致，以HBV-ACLF組最高（5.96±1.89ng/ml；12.56±2.28pg/ml），其后依次為CHB組（2.75±0.58ng/ml；3.52±0.96pg/ml）、AsC組（1.58±0.59ng/ml；2.34±0.65pg/ml）和健康對(duì)照組（1.58±0.42ng/ml；2.25±0.48pg/ml），除AsC組與健康對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05），其它各組兩兩比較具差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01或0.05）。 1.3外周血CD3 CD56+（NK）細(xì)胞，NKG2D+與IFN-γ+NK細(xì)胞頻率比較： 與健康對(duì)照組（13.58±3.24）%相比，慢性HBV感染各組PBMCs中CD3 CD56+（NK）細(xì)胞頻率均不同程度降低，以AsC組（5.42±2.18）%最低。CHB組（8.43±2.92）%、HBV-ACLF（7.92±2.85）%組患者NK細(xì)胞頻率較AsC患者不同程度升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.05），但仍顯著低于健康對(duì)照組水平（均P0.01），而HBV-ACLF與CHB組患者NK細(xì)胞頻率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 與NK細(xì)胞頻率趨勢(shì)不同，NKG2D+和IFN-γ+NK細(xì)胞占全部NK細(xì)胞比例以ACLF組患者［（18.92±5.85）%；（42.25±10.17）%］最高，其后依次為CHB組［（12.85±3.39）%；（27.95±6.12）%］、健康對(duì)照組［（8.45±2.86）%；（18.69±5.68）%］及AsC組［（3.36±1.05）%；（12.55±3.24）%］，各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01或0.05）。 1.4肝組織CD3 CD57+NK細(xì)胞，及NKG2D+、IFN-γ+細(xì)胞的表達(dá)： CHB與HBV-ACLF患者CD3 CD57+NK細(xì)胞呈彌漫分布，以淋巴細(xì)胞密集的匯管區(qū)、炎癥壞死區(qū)明顯，，在健康對(duì)照組及AsC患者極少數(shù)陽(yáng)性表達(dá)NK細(xì)胞散在分布于肝竇內(nèi)及匯管區(qū)。半定量分析顯示，HBV-ACLF患者肝組織浸潤(rùn)的CD3 CD57+NK細(xì)胞（19.6±3.5/hpf）顯著多于CHB組（8.4±3.5/hpf）、AsC組（2.5±1.3/hpf）和健康對(duì)照組（1.2±0.6/hpf），除AsC與健康對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05），其余各組兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.05）。 NKG2D+細(xì)胞主要分布于淋巴細(xì)胞聚集的炎癥壞死區(qū)。IFN-γ在健康對(duì)照組與AsC患者主要表達(dá)于個(gè)別肝細(xì)胞，而在HBV-ACLF與CHB患者同樣以炎癥壞死區(qū)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞表達(dá)為著。半定量分析顯示NKG2D+、IFN-γ+細(xì)胞均以HBV-ACLF組表達(dá)最強(qiáng)、AsC組最弱，各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.01）。 1.5肝組織中NKG2D、IFN-γ mRNA表達(dá)變化： 將健康對(duì)照組肝組織中NKG2D、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為 1.00。HBV-ACLF患者肝組織NKG2D（6.58±1.86）、IFN-γ（3.56±0.63）mRNA相對(duì)表達(dá)量最高，其后依次為CHB組（3.25±0.95；1.54±0.33）和AsC組（0.69±0.20；0.52±0.09），各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.01）。AsC組患者肝組織中NKG2D、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于健康對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.05）。 2NKG2D信號(hào)通路在TNF-α誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化殺傷HBV復(fù)制靶細(xì)胞機(jī)制中的作用 2.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功制備HBV復(fù)制型肝細(xì)胞： 利用野生型HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，篩選高復(fù)制HBV DNA細(xì)胞株（HBV-HepG2）。Real time PCR檢測(cè)HBV-HepG2細(xì)胞上清液中HBVDNA載量1.0×105-1.0×107拷貝/ml，ELISA法檢測(cè)上清液HBsAg陽(yáng)性，轉(zhuǎn)染HBV-HepG2細(xì)胞釋放IFN-γ、TNF-α水平較未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞輕度升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.05）。 2.2NK細(xì)胞殺傷活性： 經(jīng)IL-2與IL-15誘導(dǎo)維持生長(zhǎng)的NK-92細(xì)胞具有低水平殺傷活性，IFN-α刺激后，殺傷活性明顯增強(qiáng)，尤其對(duì)于HBV-HepG2細(xì)胞殺傷活性更強(qiáng)。應(yīng)用特異性單克隆抗體封閉NKG2D受體后，NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷活性減低，尤其對(duì)經(jīng)IFN-α誘導(dǎo)活化NK細(xì)胞的殺傷活性下降更為顯著，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05或0.01）。 2.3NK細(xì)胞對(duì)HBV-HepG2中HBV DNA載量的影響： 應(yīng)用單獨(dú)培養(yǎng)HBV-HepG2細(xì)胞，上清液中HBV DNA載量略有下降。未經(jīng)IFN-α干預(yù)的NK細(xì)胞與HBV-HepG2細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)上清液中HBVDNA也僅輕微下降（P0.05），但經(jīng)IFN-α干預(yù)后聯(lián)合培養(yǎng)上清液中HBVDNA載量下降顯著（P0.05）。NKG2D mAb可部分阻斷NK細(xì)胞對(duì)HBV復(fù)制的抑制效應(yīng)，尤其阻斷經(jīng)IFN-α誘導(dǎo)活化NK細(xì)胞對(duì)HBV復(fù)制的抑制效應(yīng)（P0.05）。 2.4細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B含量變化： IL-2與IL-15誘導(dǎo)維持生長(zhǎng)的NK-92細(xì)胞培養(yǎng)上清液可檢測(cè)出低水平TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B。經(jīng)IFN-α刺激后上述指標(biāo)不同程度增加（P0.05或0.01），以IFN-γ升高最著。聯(lián)合培養(yǎng)組上清液TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B水平均較單獨(dú)培養(yǎng)組升高（均P0.01），且經(jīng)IFN-α刺激后較未經(jīng)IFN-α刺激的聯(lián)合培養(yǎng)組和經(jīng)IFN-α刺激的單獨(dú)培養(yǎng)組均顯著升高（均P0.01）。應(yīng)用NKG2D mAb封閉可以顯著抑制IFN-α對(duì)上述指標(biāo)的上調(diào)效應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.01），但NKG2DmAb阻斷未能將上述指標(biāo)恢復(fù)至干預(yù)前水平。 3干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白-10募集NK細(xì)胞肝臟遷移對(duì)CHB抗病毒應(yīng)答影響 3.1各組人口基線特征及血清指標(biāo)特點(diǎn)： 健康對(duì)照組、AsC及HBV-ACLF組患者人口基線特征、血清生化學(xué)及病毒學(xué)指標(biāo)特點(diǎn)同第一部分（1.1）。另外60例前瞻隊(duì)列研究CHB患者，平均年齡37±12（16~65）歲。其中38例HBeAg陽(yáng)性、22例HBeAg陰性，兩亞組間在年齡分布、性別比例方面均具有可比性（P0.05）。 3.2抗病毒治療CHB患者生化學(xué)、病毒學(xué)及血清學(xué)應(yīng)答特點(diǎn)： 所有CHB患者均至少完成48周Peg IFN-α抗病毒治療，并于停藥后隨訪48周。至隨訪結(jié)束，76.67%（46/60）患者ALT復(fù)常，65.00%（39/60）HBV DNA低于檢測(cè)下限（500拷貝/ml）。58.33%（35/60）HBsAg下降1log10IU/ml，其中23例患者治療前為HBeAg陽(yáng)性、12例HBeAg陰性，僅8.33%（5/60）患者發(fā)生HBsAg清除。38例HBeAg陽(yáng)性患者60.53%（23/38）實(shí)現(xiàn)HBeAg清除，其中20例同時(shí)出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。 3.3各組血清IP-10、IFN-γ基線水平： HBV-ACLF與CHB組患者血清IP-10、IFN-γ基線水平明顯高于AsC和健康對(duì)照組（均P0.01），且以HBV-ACLF組最高，并與CHB組比較差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），但AsC與健康對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HBeAg陽(yáng)性患者血清IP-10水平高于HBeAg陰性患者（P0.01）�；仡櫺苑治鲲@示HBeAg清除、HBsAg下降1log10IU/ml患者較HBeAg持續(xù)陽(yáng)性及HBsAg下降1log10IU/ml患者基線IP-10水平更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 3.4CHB患者抗病毒治療過(guò)程中血清IP-10動(dòng)態(tài)變化： 伴隨抗病毒治療血清IP-10水平逐漸下降，尤其以HBeAg清除、HBsAg下降1log10IU/ml患者下降更為明顯，不僅顯著低于治療基線水平（P0.01），其下降幅度與HBeAg持續(xù)陽(yáng)性、HBsAg下降1log10IU/ml患者相比同樣具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.01）。不僅如此，對(duì)HBsAg下降1log10IU/ml組患者IP-10動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)顯示IP-10下降曲線與HBsAg下降曲線高度一致，尤其是在抗病毒治療期間。 3.5各組肝組織IP-10mRNA和蛋白表達(dá)差異： 將健康對(duì)照者肝組織IP-10mRNA表達(dá)量設(shè)定為1.00，以HBV-ACLF患者肝組織IP-10mRNA相對(duì)表達(dá)量最高（8.51±0.64），顯著高于CHB組（4.01±0.74）和AsC組（1.04±0.03），各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.01或0.05）。IP-10蛋白表達(dá)趨勢(shì)與mRNA一致，也以ACLF患者最高，其后依次為CHB、AsC和健康對(duì)照組。除AsC和健康對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其余各組兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，HBeAg陽(yáng)性CHB患者肝組織IP-10mRNA、蛋白表達(dá)水平亦高于HBeAg陰性患者（P0.01）。 3.6血清IP-10水平與血清ALT、HBV DNA、HBsAg定量，PBMCs中IFN-γ+NK頻率，肝組織IA積分、IFN-γ+細(xì)胞表達(dá)相關(guān)性分析： 血清IP-10水平與肝組織IP-10mRNA、蛋白表達(dá)相關(guān)性良好。治療前IP-10水平與血清ALT水平、PBMCs中IFN-γ+NK頻率、肝組織IA積分及IFN-γ+細(xì)胞表達(dá)均呈正相關(guān)（r=0.65，0.60，0.77，0.64，P0.01），而與血清HBV DNA載量、HBsAg滴度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.69,-0.59，P0.01） 3.7基線高IP-10水平（350pg/ml）對(duì)Peg IFN-α抗病毒治療HBeAg清除與HBsAg下降的預(yù)測(cè)價(jià)值： Logistic多元回歸分析顯示，治療前高IP-10水平（OR，6.068；95%CI，1.274-28.902）、ALT水平（OR，3.745；95%CI，0.826-16.983）是HBeAg清除的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。同樣高水平IP-10（OR，4.677；95%CI，1.102-19.841）、ALT（OR，3.186；95%CI，0.842-12.048），以及低HBV DNA載量（OR，0.364；95%CI，0.131-1.013）是HBsAg下降的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。相比而言，IP-10較其它指標(biāo)具有更強(qiáng)的預(yù)測(cè)效力。 4Peg IFN-α2a聯(lián)合ADV個(gè)體化治療提高HBeAg陽(yáng)性CHB患者抗病毒療效 4.1病毒學(xué)應(yīng)答： 治療24周，個(gè)體化治療組僅8.75%（7/80）患者HBV DNA載量較治療前無(wú)下降，其中1例在初始聯(lián)合治療組、6例在初始Peg IFN α-2a單藥治療組。雖然低于標(biāo)準(zhǔn)治療組16.25%（13/80），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。48周治療結(jié)束時(shí)，個(gè)體化治療組72.50%（58/80）患者HBVDNA低于檢測(cè)下限，高于標(biāo)準(zhǔn)治療組53.75%（43/80），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。隨訪期間，兩組患者HBV DNA反彈率分別為18.97%（11/58）和11.63%（5/43）。至隨訪結(jié)束后，兩組HBV DNA低于檢測(cè)下限率分別降至58.75%（47/80）和47.50%（38/80），兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 4.2生化學(xué)應(yīng)答： 治療24周時(shí)，個(gè)體化治療組ALT復(fù)常率57.50%（46/80），包括初始聯(lián)合治療組25例，初始單藥治療組21例，高于標(biāo)準(zhǔn)治療組40.00%（32/80）（P0.05）。但至隨訪結(jié)束時(shí)，兩組ALT復(fù)常率分別升至78.75%（63/80）和71.25%（57/80），差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 4.3HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率與HBsAg消失率： 48周治療結(jié)束時(shí)，個(gè)體化治療組HBeAg清除率、血清轉(zhuǎn)換率及HBsAg消失率分別為63.75%、56.25%和15.00%，而標(biāo)準(zhǔn)治療組僅分別為45.00%、37.50%和8.75%，兩組在HBeAg清除與血清轉(zhuǎn)換率方面比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.05）。隨訪結(jié)束時(shí)，個(gè)體化治療組HBeAg血清轉(zhuǎn)換率及HBsAg消失率分別調(diào)至53.75%和17.50%，高于標(biāo)準(zhǔn)治療組32.50%和10.00%，但僅HBeAg血清轉(zhuǎn)換率在兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。此外，全部患者中38.75%（62/160）獲得聯(lián)合應(yīng)答（HBV DNA低于檢測(cè)下限、HBeAg清除或血清學(xué)轉(zhuǎn)換，或伴有HBsAg消失），其中38例為個(gè)體化治療組、24例為標(biāo)準(zhǔn)治療組患者。 4.4安全性評(píng)估 全部患者中無(wú)因不良反應(yīng)退出試驗(yàn)者，僅1例患者因A181V位點(diǎn)突變調(diào)整為替比夫定治療。其中2例患者出現(xiàn)三碘甲狀腺原氨酸、甲狀腺素升高，同時(shí)伴隨促甲狀腺素下降。經(jīng)減量Peg IFN α-2a劑量后各指標(biāo)逐漸恢復(fù)至正常。15例患者因粒細(xì)胞顯著降低下調(diào)Peg IFN α-2a用量，但未出現(xiàn)因不良反應(yīng)而致ADV減量或停藥事件。3例患者治療后二次肝穿發(fā)現(xiàn)肝纖維化程度加重，但臨床無(wú)失代償期肝病及死亡病例發(fā)生。 結(jié)論： 1慢性HBV感染者不同臨床階段NK細(xì)胞頻率、活性、分布存在差異，提示以NK細(xì)胞為代表的固有免疫應(yīng)答參與HBV感染后宿主免疫調(diào)節(jié)，并影響疾病進(jìn)展與轉(zhuǎn)歸。 2NK細(xì)胞在肝臟內(nèi)募集、活化，參與肝臟免疫炎癥損傷，其機(jī)制部分依賴于NK細(xì)胞膜受體NKG2D活化以及合成、分泌IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B等效應(yīng)分子能力。 3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功制備HBV復(fù)制肝細(xì)胞模型，通過(guò)與NK細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)證實(shí)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的非特異殺傷活性，且IFN-α可能通過(guò)上調(diào)NKG2D受體活化及促進(jìn)IFN-γ分泌強(qiáng)化NK細(xì)胞抗病毒效應(yīng)。 4體外阻斷NKG2D信號(hào)通路能有效抑制NK細(xì)胞效應(yīng)分子合成、釋放，下調(diào)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷活性，反證NKG2D是介導(dǎo)NK細(xì)胞抗HBV感染免疫的重要信號(hào)通路之一。 5IP-10作為NK細(xì)胞重要趨化因子，參與HBV-ACLF患者外周NK細(xì)胞向肝內(nèi)遷移、聚集，并與肝組織炎癥活動(dòng)度相關(guān)，提示有效調(diào)節(jié)IP-10可減輕由NK細(xì)胞所介導(dǎo)的肝臟免疫病理?yè)p傷。 6IP-10基線水平及動(dòng)態(tài)演變與Peg IFN-α抗病毒應(yīng)答相關(guān)，高基線水平與治療中動(dòng)態(tài)下降是HBeAg清除、HBsAg下降的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)，為臨床抗病毒應(yīng)答預(yù)測(cè)提供有力證據(jù)，并可能成為臨床免疫調(diào)節(jié)治療靶點(diǎn)。 7Peg IFN-α2a聯(lián)合ADV個(gè)體化治療能夠加速HBV DNA抑制，提高治療結(jié)束時(shí)HBeAg清除及血清學(xué)轉(zhuǎn)換率，尤其24周時(shí)HBV DNA、HBeAg下降等可以作為指導(dǎo)聯(lián)合治療方案的重要依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62

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6 張愛(ài)民;中國(guó)HBV基因型分布特點(diǎn)和臨床意義及慢加急性肝衰竭患者HBV基因突變的研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2011年

7 王景玲;自發(fā)乙型肝炎E抗原/抗體雙陽(yáng)性的患者特征和形成機(jī)制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

8 資捷;HBeAg影響人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞TLR3/4表達(dá)效應(yīng)及其在母嬰傳播中作用機(jī)制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

9 秦恩強(qiáng);HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者外周血NK細(xì)胞高表達(dá)TRAIL與肝損傷關(guān)系的研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2009年

10 趙耀;HBV同時(shí)分型和定量新方法的建立及基因型對(duì)藥物敏感性的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李晨;HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及細(xì)胞因子表達(dá)和動(dòng)態(tài)變化的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

2 楊軍;成都地區(qū)乙型肝炎患者HBV基因型分布特點(diǎn)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

3 李春霞;四十歲以上HBeAg陽(yáng)性慢性HBV感染者一年臨床轉(zhuǎn)歸[D];延安大學(xué);2012年

4 高淑春;替比夫定治療慢性乙型肝炎療效與相關(guān)預(yù)測(cè)因素分析[D];山東大學(xué);2011年

5 李衛(wèi)國(guó);重組人干擾素α2b聯(lián)合胸腺肽α1治療HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎的臨床研究[D];鄭州大學(xué);2010年

6 胡萌;氧化苦參堿治療慢性乙型肝炎臨床研究[D];湖南中醫(yī)藥大學(xué);2012年

7 張建明;HBeAg（+）慢性乙型肝炎患者替比夫定抗病毒治療前后外周血iNKT細(xì)胞的變化[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

8 李春梅;慢性HBV感染相關(guān)性肝病血漿IL-12、IL-21水平檢測(cè)的臨床意義[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2012年

9 林芳;慢性乙型肝炎患者抗病毒治療前后HBeAg特異性T細(xì)胞應(yīng)答特征分析[D];川北醫(yī)學(xué)院;2012年

10 周俊卿;補(bǔ)腎方聯(lián)合拉米夫定治療HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎的初步臨床研究[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2013年

本文編號(hào)：1477404