本文關鍵詞： 肝炎乙型慢性 自然殺傷細胞 NK細胞凝集素樣受體亞家族KNKG2D/CD314） 干擾素γ誘導蛋白-10 kD（IP-10） 細胞毒性免疫　出處：《河北醫(yī)科大學》2013年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景:乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是當前嚴重社會公共衛(wèi)生問題。據(jù)WHO統(tǒng)計，全球約20億人曾感染過HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者，每年大約100萬人死于HBV感染相關終末期肝病，因而成為當前醫(yī)學界關注焦點之一。我國2006年HBV感染血清流行病學調查結果表明，1~59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18%，據(jù)此推算我國現(xiàn)有慢性HBV感染者約9300萬例，慢性乙型肝炎（chronichepatitis B，CHB）患者約2000萬例，其中15%~40%將可能死于肝衰竭、失代償期肝硬化和原發(fā)性肝癌等終末期肝病，嚴重威脅國民的健康。CHB發(fā)病機制復雜，迄今尚存在諸多問題有待深入。近年來，隨著對CHB免疫機制認識深入，國內(nèi)外學者普遍認為：HBV病毒本身并非造成肝細胞損害的首要原因，而病毒感染細胞誘發(fā)機體產(chǎn)生的一系列免疫清除反應才是造成CHB病理損傷的核心環(huán)節(jié)。因此，宿主免疫狀態(tài)是影響HBV感染后疾病轉歸的關鍵因素之一，有效調節(jié)宿主免疫功能，加強機體對HBV感染肝細胞的特異性識別，抑制甚或清除HBV并實現(xiàn)持久的免疫控制成為目前實現(xiàn)CHB理想治療目標的重要策略。 傳統(tǒng)觀念認為，CD8+細胞毒性T細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）通過特異性殺傷機制在誘發(fā)組織免疫病理損傷、特異性清除HBV環(huán)節(jié)占據(jù)主導地位，但近來研究發(fā)現(xiàn)以自然殺傷細胞（natural killer cells，NKcells）、NKT細胞為首的非特異性免疫反應在防御甚至清除HBV感染過程中亦發(fā)揮重要作用。尤其當HBV特異性CTL不足以清除病毒情況下，肝臟招募大量NK細胞向肝內(nèi)聚集、活化。在這一過程中：CXC家族趨化因子干擾素-γ誘導蛋白-10（interferon gamma inducible protein10kD，IP-10）作為肝臟募集NK細胞關鍵趨化因子，必然對NK細胞在器官、組織中重分布，以及NK細胞所介導的抗病毒免疫應答發(fā)揮重要調節(jié)作用；另一方面，以NKG2D為代表的NK細胞膜受體活化在介導突破HBV感染后免疫耐受、啟動非特異性和/或特異性免疫清除等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。因此，研究HBV感染者肝內(nèi)NK細胞募集、活化的機制及其信號通路，對明確HBV感染后慢性化/重癥化機制，探尋抗HBV免疫調控靶點、強化免疫調節(jié)療效等均具有重要現(xiàn)實意義。 目的：通過檢測慢性HBV攜帶者（chronic HBV carriers，AsC）、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）和HBV相關慢加急性肝衰竭（HBVrelated acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF）患者外周血、肝組織中NK細胞數(shù)量、活性；NK細胞膜受體NKG2D及胞內(nèi)IFN-γ陽性表達；血清、細胞培養(yǎng)上清液中NK細胞效應分子IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B表達，以及NK細胞趨化因子IP-10表達及其與肝組織炎癥損傷、NK細胞聚集、HBV復制的關系等，探討慢性HBV感染不同臨床階段NK細胞介導的免疫差異，證實NK細胞在介導慢性HBV感染者免疫活化、病理損傷、肝炎重癥化等方面的作用與機制。另一方面，通過對臨床聚乙二醇干擾素α（pegylated interferon alpha，Peg IFN-α）抗病毒治療CHB患者的隊列研究，觀察NK細胞活化、IP-10基線表達與動態(tài)變化等對抗病毒治療應答的影響，初步評估NK細胞相關指標對干擾素抗病毒治療應答的預測價值，并結合Peg IFN-α聯(lián)合阿德福韋酯（adefovir dipivoxil，ADV）抗病毒治療臨床療效觀察，為CHB患者探求免疫調控靶點及臨床優(yōu)化抗病毒策略提供實驗基礎和理論依據(jù)。 方法： 1NKG2D介導NK細胞活化對慢性HBV感染者免疫激活及重癥化影響 依據(jù)我國2010年《慢性乙型肝炎防治指南》、2006年《肝衰竭診療指南》診斷、分型標準，入選AsC、CHB、HBV-ACLF患者各15例，同期篩選15例健康獻血員作為健康對照組（healthy controls，HC）。所有納患者入組前6月均未曾接受過免疫調節(jié)、抗病毒及乙肝疫苗治療；排除HAV、HCV、HEV、EBV、CMV、HIV等合并感染；無合并酒精、藥物、代謝性、免疫性肝病及惡性腫瘤等。全自動生化分析儀測定血清白蛋白（albumin，Alb）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）等；酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）檢測血清IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B水平；實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time PCR）檢測血清HBV DNA載量；電化學發(fā)光法（electrochemiluminescence，ECL）定量檢測HBsAg、HBeAg滴度。分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測NK（CD3 CD56+）細胞、NKG2D+NK細胞頻率，胞內(nèi)因子染色法檢測IFN-γ+NK細胞頻率。肝組織標本蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，觀察炎癥、壞死程度；免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色觀察NK（CD3 CD57+）細胞分布、數(shù)量，NKG2D+、IFN-γ+細胞表達；Real time PCR檢測NKG2D、IFN-γ mRNA表達。 2NKG2D信號通路在TNF-α誘導NK細胞活化殺傷HBV復制靶細胞機制中的作用 復蘇HepG2細胞以含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的HG-DMEM培養(yǎng)基于5%CO2，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于六孔板中，每孔5×105個細胞，至60%~70%細胞融合時更換新鮮完全培養(yǎng)基，以VigoFect高效轉染試劑盒進行質粒轉染，24h后收集轉染細胞（HBV-HepG2細胞），傳代培養(yǎng)，收集細胞上清液Real-time PCR測定HBV DNA載量，驗證轉染效果，并篩選HBV DNA≥5.0×106拷貝/ml細胞進入后續(xù)實驗。同期復蘇NK-92細胞，以含12.5%胎牛血清、12.5%馬血清、200IU/ml IL-2、0.5ng/mlIL-15的α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)、傳代，MTT法驗證NK-92細胞殺傷活性，而后分組干預：單細胞培養(yǎng)組、單細胞培養(yǎng)干預組、聯(lián)合培養(yǎng)組、聯(lián)合培養(yǎng)干預組。經(jīng)24h處理后，收集細胞及培養(yǎng)上清液。ELISA檢測上清液中TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B水平，Real-time PCR定量檢測HBV DNA載量。 3干擾素-γ誘導蛋白-10募集NK細胞肝臟遷移對CHB抗病毒應答影響 橫斷面研究：病例篩選，血清ALT水平、HBV DNA載量，PBMCs中NK細胞頻率、肝組織炎癥活動度（inflammation activity，IA）積分等同第一部分。另外，ELISA法檢測血清IFN-γ及其誘導蛋白-10（interferongamma inducible protein10kD，IP-10）水平；IHC染色觀察肝組織IFN-γ、IP-10陽性表達；Real time PCR檢測肝組織IFN-γ、IP-10mRNA表達。 隊列研究：納入2010年1月~2011年12月接受Peg IFN α抗病毒治療CHB患者60例，入選病例符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》標準，同時滿足下列條件：18~65歲；HBV DNA≥104拷貝/ml；80U/L ALT 400U/L，和/或經(jīng)肝組織病理證實炎癥分級≥G2；6個月內(nèi)未曾接受過抗病毒、免疫調節(jié)劑及乙肝疫苗治療。排除妊娠及哺乳期女性，無HAV、HCV、HEV或HIV合并感染，無惡性腫瘤、自身免疫性疾病、未控制的糖尿病、甲狀腺疾病，既往精神病史，或其他系統(tǒng)嚴重疾病、干擾素用藥禁忌等情況。收集患者抗病毒治療前、治療中、停藥隨訪期血清，用于ALT、AST、HBV DNA、HBsAg、HBeAg及細胞因子IFN-γ、IP-10動態(tài)監(jiān)測；收集部分患者治療前、后肝穿刺組織標本，進行組織病理及分子生物學檢測（檢測指標及方法同橫斷面研究）。 4Peg IFN-α2a聯(lián)合ADV個體化治療提高HBeAg陽性CHB患者抗病毒療效 本隊列研究納入符合干擾素抗病毒治療HBeAg陽性CHB患者160例（納入與排除標準同前）。所有患者1：1比例隨機分配進入干擾素標準治療組和個體化治療組。標準治療組患者接受Peg IFN α-2a標準治療，個體化治療組又依據(jù)患者基線HBV DNA載量和/或肝纖維化程度亞分為初始Peg IFN α-2a與ADV聯(lián)合治療組（38例，HBV1.0×107copies/ml和/或肝纖維化≥S3）和初始Peg IFN α-2a單藥治療組（42例）。治療24周后，對個體化治療組療效初評，并依據(jù)抗病毒應答重新分組：對HBV DNA低于檢測下限、HBeAg清除及ALT復常患者，繼續(xù)（或調整為）Peg IFN α-2a單藥治療，余者均繼續(xù)（或調整為）Peg IFN α-2a聯(lián)合ADV治療至療程結束。所有患者均接受至少48周抗病毒治療，并隨訪至96周，常規(guī)檢測生化學、病毒學、血清學等指標及血常規(guī)、肝腎功能、甲狀腺功能等，動態(tài)觀察患者抗病毒治療療效、安全性、耐藥率及停藥復發(fā)率等。 結果: 1NKG2D介導NK細胞活化對慢性HBV感染者免疫激活及重癥化影響 1.1人口基線特征與血清指標特點： 各組患者在年齡構成、性別比例具有可比性。HBV-ACLF患者血清ALT、TBil水平均顯著高于、PTA水平顯著低于CHB及AsC患者（均P0.01）。與CHB患者相比，HBV-ACLF患者HBV DNA載量、HBeAg滴度偏低，差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01或0.05）。 1.2血清IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B水平變化： HBV-ACLF組患者血清IFN-γ（10.78±1.19pg/ml）、TNF-α（118.25±25.36pg/ml）水平均顯著高于CHB組（6.98±1.12pg/ml；69.54±17.35pg/ml）、AsC組（2.24±0.45pg/ml；26.25±6.37pg/ml），兩兩比較各組差異均具有統(tǒng)計學意義（均P0.01）。各組血清IFN-γ、TNF-α水平以健康對照組（1.98±0.58pg/ml；24.58±6.15pg/ml）最低，但與AsC組比較無統(tǒng)計學差異（P0.05）。 血清穿孔素、顆粒酶B變化趨勢與IFN-γ一致，以HBV-ACLF組最高（5.96±1.89ng/ml；12.56±2.28pg/ml），其后依次為CHB組（2.75±0.58ng/ml；3.52±0.96pg/ml）、AsC組（1.58±0.59ng/ml；2.34±0.65pg/ml）和健康對照組（1.58±0.42ng/ml；2.25±0.48pg/ml），除AsC組與健康對照組比較無統(tǒng)計學差異（P0.05），其它各組兩兩比較具差異均具有統(tǒng)計學意義（P0.01或0.05）。 1.3外周血CD3 CD56+（NK）細胞，NKG2D+與IFN-γ+NK細胞頻率比較： 與健康對照組（13.58±3.24）%相比，慢性HBV感染各組PBMCs中CD3 CD56+（NK）細胞頻率均不同程度降低，以AsC組（5.42±2.18）%最低。CHB組（8.43±2.92）%、HBV-ACLF（7.92±2.85）%組患者NK細胞頻率較AsC患者不同程度升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P0.05），但仍顯著低于健康對照組水平（均P0.01），而HBV-ACLF與CHB組患者NK細胞頻率比較無統(tǒng)計學差異（P0.05）。 與NK細胞頻率趨勢不同，NKG2D+和IFN-γ+NK細胞占全部NK細胞比例以ACLF組患者［（18.92±5.85）%；（42.25±10.17）%］最高，其后依次為CHB組［（12.85±3.39）%；（27.95±6.12）%］、健康對照組［（8.45±2.86）%；（18.69±5.68）%］及AsC組［（3.36±1.05）%；（12.55±3.24）%］，各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P0.01或0.05）。 1.4肝組織CD3 CD57+NK細胞，及NKG2D+、IFN-γ+細胞的表達： CHB與HBV-ACLF患者CD3 CD57+NK細胞呈彌漫分布，以淋巴細胞密集的匯管區(qū)、炎癥壞死區(qū)明顯，，在健康對照組及AsC患者極少數(shù)陽性表達NK細胞散在分布于肝竇內(nèi)及匯管區(qū)。半定量分析顯示，HBV-ACLF患者肝組織浸潤的CD3 CD57+NK細胞（19.6±3.5/hpf）顯著多于CHB組（8.4±3.5/hpf）、AsC組（2.5±1.3/hpf）和健康對照組（1.2±0.6/hpf），除AsC與健康對照組比較無統(tǒng)計學差異（P0.05），其余各組兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義（均P0.05）。 NKG2D+細胞主要分布于淋巴細胞聚集的炎癥壞死區(qū)。IFN-γ在健康對照組與AsC患者主要表達于個別肝細胞，而在HBV-ACLF與CHB患者同樣以炎癥壞死區(qū)浸潤的淋巴細胞表達為著。半定量分析顯示NKG2D+、IFN-γ+細胞均以HBV-ACLF組表達最強、AsC組最弱，各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義（均P0.01）。 1.5肝組織中NKG2D、IFN-γ mRNA表達變化： 將健康對照組肝組織中NKG2D、IFN-γ mRNA相對表達量設定為 1.00。HBV-ACLF患者肝組織NKG2D（6.58±1.86）、IFN-γ（3.56±0.63）mRNA相對表達量最高，其后依次為CHB組（3.25±0.95；1.54±0.33）和AsC組（0.69±0.20；0.52±0.09），各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義（均P0.01）。AsC組患者肝組織中NKG2D、IFN-γ mRNA相對表達量均低于健康對照組，且差異具有統(tǒng)計學意義（均P0.05）。 2NKG2D信號通路在TNF-α誘導NK細胞活化殺傷HBV復制靶細胞機制中的作用 2.1質粒轉染成功制備HBV復制型肝細胞： 利用野生型HBV質粒轉染HepG2細胞，篩選高復制HBV DNA細胞株（HBV-HepG2）。Real time PCR檢測HBV-HepG2細胞上清液中HBVDNA載量1.0×105-1.0×107拷貝/ml，ELISA法檢測上清液HBsAg陽性，轉染HBV-HepG2細胞釋放IFN-γ、TNF-α水平較未轉染的HepG2細胞輕度升高，但差異無統(tǒng)計學意義（均P0.05）。 2.2NK細胞殺傷活性： 經(jīng)IL-2與IL-15誘導維持生長的NK-92細胞具有低水平殺傷活性，IFN-α刺激后，殺傷活性明顯增強，尤其對于HBV-HepG2細胞殺傷活性更強。應用特異性單克隆抗體封閉NKG2D受體后，NK細胞對靶細胞殺傷活性減低，尤其對經(jīng)IFN-α誘導活化NK細胞的殺傷活性下降更為顯著，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05或0.01）。 2.3NK細胞對HBV-HepG2中HBV DNA載量的影響： 應用單獨培養(yǎng)HBV-HepG2細胞，上清液中HBV DNA載量略有下降。未經(jīng)IFN-α干預的NK細胞與HBV-HepG2細胞聯(lián)合培養(yǎng)上清液中HBVDNA也僅輕微下降（P0.05），但經(jīng)IFN-α干預后聯(lián)合培養(yǎng)上清液中HBVDNA載量下降顯著（P0.05）。NKG2D mAb可部分阻斷NK細胞對HBV復制的抑制效應，尤其阻斷經(jīng)IFN-α誘導活化NK細胞對HBV復制的抑制效應（P0.05）。 2.4細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B含量變化： IL-2與IL-15誘導維持生長的NK-92細胞培養(yǎng)上清液可檢測出低水平TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B。經(jīng)IFN-α刺激后上述指標不同程度增加（P0.05或0.01），以IFN-γ升高最著。聯(lián)合培養(yǎng)組上清液TNF-α、IFN-γ、穿孔素、顆粒酶B水平均較單獨培養(yǎng)組升高（均P0.01），且經(jīng)IFN-α刺激后較未經(jīng)IFN-α刺激的聯(lián)合培養(yǎng)組和經(jīng)IFN-α刺激的單獨培養(yǎng)組均顯著升高（均P0.01）。應用NKG2D mAb封閉可以顯著抑制IFN-α對上述指標的上調效應，差異具有統(tǒng)計學意義（均P0.01），但NKG2DmAb阻斷未能將上述指標恢復至干預前水平。 3干擾素-γ誘導蛋白-10募集NK細胞肝臟遷移對CHB抗病毒應答影響 3.1各組人口基線特征及血清指標特點： 健康對照組、AsC及HBV-ACLF組患者人口基線特征、血清生化學及病毒學指標特點同第一部分（1.1）。另外60例前瞻隊列研究CHB患者，平均年齡37±12（16~65）歲。其中38例HBeAg陽性、22例HBeAg陰性，兩亞組間在年齡分布、性別比例方面均具有可比性（P0.05）。 3.2抗病毒治療CHB患者生化學、病毒學及血清學應答特點： 所有CHB患者均至少完成48周Peg IFN-α抗病毒治療，并于停藥后隨訪48周。至隨訪結束，76.67%（46/60）患者ALT復常，65.00%（39/60）HBV DNA低于檢測下限（500拷貝/ml）。58.33%（35/60）HBsAg下降1log10IU/ml，其中23例患者治療前為HBeAg陽性、12例HBeAg陰性，僅8.33%（5/60）患者發(fā)生HBsAg清除。38例HBeAg陽性患者60.53%（23/38）實現(xiàn)HBeAg清除，其中20例同時出現(xiàn)HBeAg血清學轉換。 3.3各組血清IP-10、IFN-γ基線水平： HBV-ACLF與CHB組患者血清IP-10、IFN-γ基線水平明顯高于AsC和健康對照組（均P0.01），且以HBV-ACLF組最高，并與CHB組比較差異亦具有統(tǒng)計學意義（P0.01），但AsC與健康對照組比較無統(tǒng)計學差異。HBeAg陽性患者血清IP-10水平高于HBeAg陰性患者（P0.01）�；仡櫺苑治鲲@示HBeAg清除、HBsAg下降1log10IU/ml患者較HBeAg持續(xù)陽性及HBsAg下降1log10IU/ml患者基線IP-10水平更高，差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01）。 3.4CHB患者抗病毒治療過程中血清IP-10動態(tài)變化： 伴隨抗病毒治療血清IP-10水平逐漸下降，尤其以HBeAg清除、HBsAg下降1log10IU/ml患者下降更為明顯，不僅顯著低于治療基線水平（P0.01），其下降幅度與HBeAg持續(xù)陽性、HBsAg下降1log10IU/ml患者相比同樣具有顯著統(tǒng)計學差異（P0.01）。不僅如此，對HBsAg下降1log10IU/ml組患者IP-10動態(tài)監(jiān)測顯示IP-10下降曲線與HBsAg下降曲線高度一致，尤其是在抗病毒治療期間。 3.5各組肝組織IP-10mRNA和蛋白表達差異： 將健康對照者肝組織IP-10mRNA表達量設定為1.00，以HBV-ACLF患者肝組織IP-10mRNA相對表達量最高（8.51±0.64），顯著高于CHB組（4.01±0.74）和AsC組（1.04±0.03），各組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（均P0.01或0.05）。IP-10蛋白表達趨勢與mRNA一致，也以ACLF患者最高，其后依次為CHB、AsC和健康對照組。除AsC和健康對照組比較無統(tǒng)計學差異外，其余各組兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義。此外，HBeAg陽性CHB患者肝組織IP-10mRNA、蛋白表達水平亦高于HBeAg陰性患者（P0.01）。 3.6血清IP-10水平與血清ALT、HBV DNA、HBsAg定量，PBMCs中IFN-γ+NK頻率，肝組織IA積分、IFN-γ+細胞表達相關性分析： 血清IP-10水平與肝組織IP-10mRNA、蛋白表達相關性良好。治療前IP-10水平與血清ALT水平、PBMCs中IFN-γ+NK頻率、肝組織IA積分及IFN-γ+細胞表達均呈正相關（r=0.65，0.60，0.77，0.64，P0.01），而與血清HBV DNA載量、HBsAg滴度呈負相關（r=-0.69,-0.59，P0.01） 3.7基線高IP-10水平（350pg/ml）對Peg IFN-α抗病毒治療HBeAg清除與HBsAg下降的預測價值： Logistic多元回歸分析顯示，治療前高IP-10水平（OR，6.068；95%CI，1.274-28.902）、ALT水平（OR，3.745；95%CI，0.826-16.983）是HBeAg清除的獨立預測因素。同樣高水平IP-10（OR，4.677；95%CI，1.102-19.841）、ALT（OR，3.186；95%CI，0.842-12.048），以及低HBV DNA載量（OR，0.364；95%CI，0.131-1.013）是HBsAg下降的獨立預測因素。相比而言，IP-10較其它指標具有更強的預測效力。 4Peg IFN-α2a聯(lián)合ADV個體化治療提高HBeAg陽性CHB患者抗病毒療效 4.1病毒學應答： 治療24周，個體化治療組僅8.75%（7/80）患者HBV DNA載量較治療前無下降，其中1例在初始聯(lián)合治療組、6例在初始Peg IFN α-2a單藥治療組。雖然低于標準治療組16.25%（13/80），但無統(tǒng)計學差異（P0.05）。48周治療結束時，個體化治療組72.50%（58/80）患者HBVDNA低于檢測下限，高于標準治療組53.75%（43/80），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。隨訪期間，兩組患者HBV DNA反彈率分別為18.97%（11/58）和11.63%（5/43）。至隨訪結束后，兩組HBV DNA低于檢測下限率分別降至58.75%（47/80）和47.50%（38/80），兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。 4.2生化學應答： 治療24周時，個體化治療組ALT復常率57.50%（46/80），包括初始聯(lián)合治療組25例，初始單藥治療組21例，高于標準治療組40.00%（32/80）（P0.05）。但至隨訪結束時，兩組ALT復常率分別升至78.75%（63/80）和71.25%（57/80），差異比較無統(tǒng)計學意義（P0.05）。 4.3HBeAg血清學轉換率與HBsAg消失率： 48周治療結束時，個體化治療組HBeAg清除率、血清轉換率及HBsAg消失率分別為63.75%、56.25%和15.00%，而標準治療組僅分別為45.00%、37.50%和8.75%，兩組在HBeAg清除與血清轉換率方面比較差異均具有統(tǒng)計學意義（均P0.05）。隨訪結束時，個體化治療組HBeAg血清轉換率及HBsAg消失率分別調至53.75%和17.50%，高于標準治療組32.50%和10.00%，但僅HBeAg血清轉換率在兩組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。此外，全部患者中38.75%（62/160）獲得聯(lián)合應答（HBV DNA低于檢測下限、HBeAg清除或血清學轉換，或伴有HBsAg消失），其中38例為個體化治療組、24例為標準治療組患者。 4.4安全性評估 全部患者中無因不良反應退出試驗者，僅1例患者因A181V位點突變調整為替比夫定治療。其中2例患者出現(xiàn)三碘甲狀腺原氨酸、甲狀腺素升高，同時伴隨促甲狀腺素下降。經(jīng)減量Peg IFN α-2a劑量后各指標逐漸恢復至正常。15例患者因粒細胞顯著降低下調Peg IFN α-2a用量，但未出現(xiàn)因不良反應而致ADV減量或停藥事件。3例患者治療后二次肝穿發(fā)現(xiàn)肝纖維化程度加重，但臨床無失代償期肝病及死亡病例發(fā)生。 結論： 1慢性HBV感染者不同臨床階段NK細胞頻率、活性、分布存在差異，提示以NK細胞為代表的固有免疫應答參與HBV感染后宿主免疫調節(jié)，并影響疾病進展與轉歸。 2NK細胞在肝臟內(nèi)募集、活化，參與肝臟免疫炎癥損傷，其機制部分依賴于NK細胞膜受體NKG2D活化以及合成、分泌IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B等效應分子能力。 3質粒轉染成功制備HBV復制肝細胞模型，通過與NK細胞聯(lián)合培養(yǎng)證實NK細胞對靶細胞的非特異殺傷活性，且IFN-α可能通過上調NKG2D受體活化及促進IFN-γ分泌強化NK細胞抗病毒效應。 4體外阻斷NKG2D信號通路能有效抑制NK細胞效應分子合成、釋放，下調NK細胞對靶細胞殺傷活性，反證NKG2D是介導NK細胞抗HBV感染免疫的重要信號通路之一。 5IP-10作為NK細胞重要趨化因子，參與HBV-ACLF患者外周NK細胞向肝內(nèi)遷移、聚集，并與肝組織炎癥活動度相關，提示有效調節(jié)IP-10可減輕由NK細胞所介導的肝臟免疫病理損傷。 6IP-10基線水平及動態(tài)演變與Peg IFN-α抗病毒應答相關，高基線水平與治療中動態(tài)下降是HBeAg清除、HBsAg下降的重要預測指標，為臨床抗病毒應答預測提供有力證據(jù)，并可能成為臨床免疫調節(jié)治療靶點。 7Peg IFN-α2a聯(lián)合ADV個體化治療能夠加速HBV DNA抑制，提高治療結束時HBeAg清除及血清學轉換率，尤其24周時HBV DNA、HBeAg下降等可以作為指導聯(lián)合治療方案的重要依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.62

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本文編號：1477404