本文關(guān)鍵詞： 艾滋病 腸屏障 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞因子 艾滋病 腸道屏障功能 腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分：艾滋病患者腸道屏障功能的變化和機(jī)制研究目的研究艾滋病患者腸道機(jī)械屏障、生物屏障及免疫屏障功能的變化,探討艾滋病對(duì)腸道屏障的影響,并初步揭示其相關(guān)機(jī)制。方法應(yīng)用培養(yǎng)法進(jìn)行大腸桿菌、雙歧桿菌、糞腸球菌及乳酸桿菌的測(cè)定,并提取待測(cè)糞便標(biāo)本細(xì)菌DNA,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),研究艾滋病患者腸道生物屏障功能的變化：根據(jù)細(xì)菌的cfiA基因序列設(shè)計(jì)脆弱類桿菌的特異性引物,16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)雙歧桿菌屬引物,rrnA-16S基因序列設(shè)計(jì)梭菌屬的特異性引物,cfxA基因序列設(shè)計(jì)類桿菌屬的特異性引物,gyrB基因序列設(shè)計(jì)壞死梭桿菌的特異性引物,ddl基因序列設(shè)計(jì)糞腸球菌及屎腸球菌的特異性引物；swp84基因序列設(shè)計(jì)艱難梭菌的特異性引物,mob基因序列設(shè)計(jì)單形類桿菌的特異性引物,16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)多形類桿菌、梭桿菌屬的特異性引物；rpoB基因序列設(shè)計(jì)卵形類桿菌、吉氏類桿菌、普通類桿菌的特異性引物,BoNT基因序列設(shè)計(jì)肉毒梭菌的特異性引物,16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)乳酸桿菌屬、大腸桿菌,收集艾滋病患者糞便標(biāo)本50份和健康人糞便標(biāo)本50份,測(cè)定不同細(xì)菌的數(shù)量,分析兩組人群腸道微生態(tài)的差異。應(yīng)用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn),研究艾滋病患者腸道機(jī)械屏障功能的變化：收集艾滋病患者血液標(biāo)本50份和健康人血液標(biāo)本50份,提取血漿,測(cè)定二胺氧化酶(DAO)、血漿D-乳酸(D-LA)、血漿脂多糖/內(nèi)毒素(LPS)、腸脂肪酸結(jié)合蛋白(iFABP)、抗內(nèi)毒素核心抗體(EndoCab)及可溶性CD14(sCD14)的指標(biāo)變化,分析AIDS患者腸道機(jī)械屏障功能的變化情況。應(yīng)用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn),研究艾滋病患者腸道免疫屏障功能的變化：收集艾滋病患者血液標(biāo)本50份和健康人血液標(biāo)本50份,提取血漿,測(cè)定分泌型免疫球蛋白A (sIgA),白細(xì)胞介素-12(IL-12)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)、腫瘤壞死因子-α (Tumor necrosis factor, TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β (IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、細(xì)胞凋亡膜表面分子(FAS)及細(xì)胞凋亡膜表面分子配體(FASL)的指標(biāo)變化,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T細(xì)胞的變化,分析AIDS患者腸道免疫屏障功能的變化情況；測(cè)定肱三頭肌皮褶厚度,上臂周徑,淋巴細(xì)胞總數(shù),體重指數(shù),血清前白蛋白,血清白蛋白,血紅蛋白,分析AIDS患者營(yíng)養(yǎng)狀況。結(jié)果 正常對(duì)照組與艾滋病患者組糞便中細(xì)菌數(shù)量培養(yǎng)法分別為大腸桿菌(5.35±0.52 vs 6.51±0.62)、雙歧桿菌屬(8.63±0.71 vs 4.48±0.27)、糞腸球菌(5.72±0.38 vs 6.52±0.61)及乳酸桿菌屬(7.38±0.44 vs 3.54±0.36)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分別為乳酸桿菌屬(7.35±0.46 vs 5.12±0.48)和雙歧桿菌屬(9.14±0.72 vs5.74±0.58)數(shù)量較正常組明顯減少(P0.05)。糞腸球菌(5.85±0.55 vs 7.08±0.72),大腸桿菌(5.77±0.43 vs 7.58±0.78),屎腸球菌(5.24±0.54 vs 7.38±0.76),梭桿菌屬(7.95±0.83 vs 8.79±0.64),類桿菌屬(7.67±0.85 vs 8.66±0.58),梭菌屬(4.55±0.38 vs 6.13±0.24),類桿菌屬中吉氏類桿菌為(4.22±1.21 vs 5.54±1.46)、脆弱類桿菌為(3.25±0.48 vs 4.06±0.58)、普通類桿菌為(2.93±0.30 vs 4.49±1.22),單形類桿菌為(5.58±0.85 vs 6.72±0.83)、卵形類桿菌為(5.76±1.02 vs 7.07±1.65)、多形類桿菌為(5.02±0.51 vs 6.42±1.34)、梭菌屬中的肉毒梭菌為(2.78±1.14 vs5.38±0.45)；艱難梭菌為(1.65±0.26 vs 3.45±0.47),梭桿菌屬中的壞死梭桿菌為(2.32±0.26 vs 6.34±0.62),艾滋病組數(shù)量較正常組明顯增多(P0.05)。正常對(duì)照組與艾滋病患者組血漿二胺氧化酶(DAO)為(0.97±0.18 u/ml vs 1.43 ±0.28 u/ml)、血漿D-乳酸(D-LA)為(25.92±3.25umol／L vs 38.92±5.89 umol/L)、血漿脂多糖/內(nèi)毒素(LPS)為(32.82±5.28 ng/ml vs 66.68±7.85 ng/ml)、腸脂肪酸結(jié)合蛋白(iFABP)為(99.12±10.56 Pg/ml vs 156.22±18.78 Pg/ml)、血漿可溶性CD14(sCD14)為：(0.43±0.03 ug/mL vs 0.74±0.22 ug/mL)、血漿抗內(nèi)毒素核心抗體(EndoCAb)為(20.36±0.88 MMU/L vs 24.33±2.34 MMU/L)艾滋病組較正常組明顯增多(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血漿分泌型IgA(sIgA)為：(62.4±14.21pg/mL vs 27.56±1.43 pg/mL)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)為：(2.74±0.35pg/mL vs 0.72±0.32 pg/mL)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)為：(20.28 ±4.83pg/mL vs 5.75±0.97pg/mL)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)為：(11.4± 4.12pg/mL vs 6.61±1.32 pg/mL)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)為：(23.2±3.21pg/mL; 7.03±0.60pg/mL)及白細(xì)胞介素-6(IL-6)為：(10.86±4.15ng/L vs 1.13± 0.47ng/L),CD4+為：(40.75±4.73 vs 30.52±4.52).CD8+為：(23.72±3.72 vs 14.75 ±1.58)、CD4+/CD8+T細(xì)胞為：(1.86±0.83 vs 1.26±0.23),肱三頭肌皮褶厚度(TSF)為：(11.28±1.82mm vs 7.08±0.17mm),上臂周徑(AC)為：(24.82± 3.28cm vs 20.75±2.78cm),淋巴細(xì)胞總數(shù)(TLC)為：(1.79±0.54 vs 0.78±0.12),體重指數(shù)(BMI)為：(22.8±0.58 vs 17.12±0.23),血清前白蛋白(PALB)為：(180.5±20.5 vs 110.5±13.2),血清白蛋白(ALB)為：(38.5±3.85 vs 27.25±2.87),血紅蛋白(Hb)為：(123.35±13.83 vs 98.28±10.12),艾滋病組較正常組明顯減少(P0.05),白細(xì)胞介素-10(IL-10)為：(37.6±10.5ug/L vs 79.5±13.2 ug/L)、細(xì)胞凋亡膜表面分子(FAS)為：(0.33±0.12 pg/mL vs 1.21±0.13 pg/mL)及細(xì)胞凋亡膜表面分子配體(FASL)為：(42.21±5.14 Pg/mL vs 82.49±6.72 pg/mL)艾滋病組較正常組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論艾滋病患者腸道微生態(tài)發(fā)生了明顯變化,提示艾滋病患者的腸道菌群失調(diào),細(xì)菌和內(nèi)毒素移位；艾滋病患者腸機(jī)械和免疫屏障功能明顯受損,營(yíng)養(yǎng)狀況和免疫水平明顯降低。第二部分：腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)艾滋病患者腸道屏障功能的影響及機(jī)制研究目的研究艾滋病患者服用腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)前和服用4周后腸道生物屏障、機(jī)械屏障及免疫屏障功能的變化,探討對(duì)艾滋病患者腸道屏障的影響,為進(jìn)一步研究其發(fā)生機(jī)制及臨床治療艾滋病提供新的理論依據(jù)及實(shí)踐意義。方法將艾滋病患者(n=50)給予普通腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)治療。于4周后采集患者糞便標(biāo)本,提取細(xì)菌DNA,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量；收集患者血液標(biāo)本,提取血漿,應(yīng)用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn),測(cè)定二胺氧化酶(DAO)、血漿D-乳酸(D-LA)、血漿脂多糖/內(nèi)毒素(LPS)、腸脂肪酸結(jié)合蛋白(iFABP)、抗內(nèi)毒素核心抗體(EndoCab)及可溶性CD14(sCD14)的指標(biāo)變化,分析AIDS患者腸道機(jī)械屏障功能的變化情況。應(yīng)用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn),測(cè)定測(cè)定分泌型免疫球蛋白A (sIgA),白細(xì)胞介素-12(IL-12)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)、腫瘤壞死因子-α (Tumor necrosis factor, TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β (IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、細(xì)胞凋亡膜表面分子(FAS)及細(xì)胞凋亡膜表面分子配體(FASL)的指標(biāo)變化,分析AIDS患者腸道免疫屏障功能的變化情況。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T細(xì)胞的變化,分析腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)后AIDS患者腸道免疫屏障功能的變化情況；測(cè)定肱三頭肌皮褶厚度,上臂周徑,淋巴細(xì)胞總數(shù),體重指數(shù),血清前白蛋白,血清白蛋白,血紅蛋白,分析腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)后AIDS患者營(yíng)養(yǎng)狀況的改善情況。結(jié)果艾滋病患者服用腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)4周前后比較,糞便中細(xì)菌數(shù)量培養(yǎng)法分別為乳酸桿菌屬(3.54±0.36；6.76±1.26),雙歧桿菌屬(4.48±0.27 vs 7.15±0.72)數(shù)量較服用前明顯增加(P0.05)。大腸桿菌(6.51±0.62 vs 5.23±0.55),糞腸球菌(6.52±0.61 vs 4.82±0.42)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分別為乳酸桿菌屬(5.12±0.48vs 7.86±1.13),雙歧桿菌屬(5.74±0.58 vs 8.25±1.27)數(shù)量較服用前明顯增加(P0.05)。大腸桿菌(7.58±0.78vs6.21±1.07),糞腸球菌(7.08±0.72vs4.78±0.82),屎腸球菌(7.38±0.76 vs 6.13±0.87),梭桿菌屬(8.79±0.64 vs 7.62±0.54),類桿菌屬(8.66±0.58 vs 7.55±0.44),梭菌屬(6.13±0.24 vs 4.32±0.38),類桿菌屬中吉氏類桿菌為(5.54±1.46 vs 4.33±1.22)、脆弱類桿菌為(4.06±0.58vs3.14±0.42)、普通類桿菌為(4.49±1.22 vs 3.21±0.46)、單形類桿菌為(6.72±0.83 vs 5.67±0.62)、卵形類桿菌為(7.07±1.65 vs 5.85±1.21)、多形類桿菌為(6.42±1.34 vs5.12±0.63)、梭菌屬中的肉毒梭菌為(5.38±0.45vs2.47±0.34)；艱難梭菌為(3.45±0.47 vs 1.43±0.24),梭桿菌屬中的壞死梭桿菌為(6.34±0.62 vs 3.57±0.46),服用腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)后數(shù)量明顯降低(P0.05)。血漿二胺氧化酶(DAO)為(1.43±0.28u/ml .vs 1.23±0.13 u/ml)、血漿D-乳酸(D-LA)為(38.92±5.89umol/L vs 30.44 ±4.81 umol/L)、血漿脂多糖/內(nèi)毒素(LPS)為(66.68±7.85ng/ml vs 51.03± 5.26 ng/ml)、腸脂肪酸結(jié)合蛋白(iFABP)為(156.22±18.78pg/ml vs 120.75± 15.55Pg/ml)、血漿可溶性CD14(sCD14)為：(0.74±0.22ug/mL vs 0.58± 0.24ug/mL)、血漿抗內(nèi)毒素核心抗體(EndoCAb)為(24.33±2.34MMU/L vs 22.18 ±2.15MMU/L)服用腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)后數(shù)量明顯降低(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血漿分泌型IgA(sIgA)為：(27.56±1.43 pg/mL；43.30±3.16 pg/mL)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)為：(1.13±0.47ng/L vs 2.72±0.52ng/L)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)為：(6.61±1.32 pg/mL vs 8.77±1.22 pg/mL)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)為：(7.03 ±0.60pg/mL vs 9.36±1.48pg/mL)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)為：(0.72±0.32 pg/mL vs 1.53±0.27pg/mL)及白細(xì)胞介素-17(IL-17)為：(5.75±0.97pg/mL vs 8.79 ±0.36pg/mL),服用腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)后數(shù)量明顯升高(P0.05),白細(xì)胞介素-10(IL-10)為：(79.5±13.2 ug/L vs 48.3±11.2 ug/L)、細(xì)胞凋亡膜表面分子(FAS)為：(1.21±0.13pg/mL vs 0.52±0.12pg/mL)及細(xì)胞凋亡膜表面分子配體(FASL)為：(82.49±6.72pg/mL vs 49.61±4.76pg/mL)服用腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)后數(shù)量明顯降低(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CD4+為：(30.52±4.52 vs 38.25±3.82)、CD8+為：(14.75±1.58 vs 21.57±3.14).CD4+/CD8+T細(xì)胞為：(1.26±0.23 vs 1.78±0.42),肱三頭肌皮褶厚度(TSF)為：(7.08±0.17mm vs 10.06±1.28mm),上臂周徑(AC)為:(20.75±2.78cm vs 23.28±2.35cm),淋巴細(xì)胞總數(shù)(TLC)為:(0.78±0.12vs 1.62±0.25),體重指數(shù)(BMI)為：(17.12±0.23 vs 21.62±2.26),血清前白蛋白(PALB)為：(110.5±13.2 vs 165.32±17.25),血清白蛋白(ALB)為：(27.25±2.87 vs 32.24±3.32),血紅蛋白(Hb)為：(98.28±10.12 vs 110.21±11.15),艾滋病患者服用腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)后明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)艾滋病患者腸道益生菌有升高作用,抑制腸道條件致病菌,能改善艾滋病患者腸道微生態(tài)。腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)AIDS患者的腸道機(jī)械和免疫屏障功能具有修復(fù)作用,能改善其營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和免疫功能,為進(jìn)一步研究其發(fā)生機(jī)制及臨床治療提供新的理論依據(jù)及實(shí)踐意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R512.91

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1461333