本文關(guān)鍵詞： 登革病毒 MMP3 NFκB　出處：《蘇州大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：登革病毒是當今世界上分布最廣的一種蟲媒傳染病毒，主要由叮咬人的埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播。據(jù)WHO估計，全球每年新增數(shù)百萬的登革病毒感染者，因登革病毒感染導致死亡的人數(shù)約2.5萬。目前，登革病毒感染的機制仍不明確，由于各血清型之間缺乏有效的交叉保護，又存在抗體依賴的增強作用等，至今仍無安全有效的疫苗可用。因此，研究宿主抗登革病毒的分子機制，，對于了解登革熱的發(fā)病過程具有重要意義。 我們實驗室從JAK-STAT信號通路入手，來研究宿主細胞抗登革病毒感染的分子機制，著重關(guān)注包括基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP3）在內(nèi)的幾個JAK-STAT下游效應(yīng)分子在抗登革病毒感染中的具體作用。我們研究在登革病毒感染巨噬細胞前后，84個JAK-STAT相關(guān)基因的表達變化。結(jié)果顯示基質(zhì)金屬蛋白酶MMP3表達上調(diào)了3.68倍。為了進一步驗證PCR芯片的結(jié)果，我們又用定量PCR的方法在多種細胞中證明了MMP3在登革病毒感染的細胞中表達上調(diào)。抑制MMP3的表達，病毒的感染水平顯著上升；而在RAW264.7細胞中過表達MMP3又可以抑制登革病毒的復制，這就揭示MMP3具有抗登革病毒感染的作用。 為了了解MMP3抗病毒的分子機制，我們分別檢測了MMP3沉默的細胞和對照細胞經(jīng)登革病毒感染后，代表性抗病毒相關(guān)細胞因子的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MMP3沉默的細胞中，抗病毒相關(guān)細胞因子和趨化因子的表達水平顯著降低。免疫熒光發(fā)現(xiàn)MMP3在登革病毒感染的細胞中會發(fā)生從細胞質(zhì)到細胞核的遷移；而且雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，在病毒感染的細胞中，沉默掉MMP3，NFκB的轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)，過表達MMP3又可以很強地激活NFκB。鑒于以上這些結(jié)果，我們推測MMP3很有可能是通過進入細胞核來影響NFκB的轉(zhuǎn)錄活性從而達到抗病毒作用。在后續(xù)實驗中通過采用熒光定位和免疫共沉淀的方法得到了MMP3與NFκB在登革病毒感染的細胞中存在相互作用的結(jié)果。 MMP3由信號域，前肽域，催化域，鉸鏈區(qū)和羧基末端域等5個結(jié)構(gòu)域組成，為了檢測與NFκB相互作用的結(jié)構(gòu)域，我們構(gòu)建了含MMP3各個結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒，并分別與NFκB的兩個亞基（P50; P65）共轉(zhuǎn)染293T細胞進行免疫共沉淀實驗。結(jié)果顯示MMP3主要依賴于其羧基末端域與NFκB相互作用。進一步的報告基因檢測實驗結(jié)果顯示：MMP3的羧基末端域可以更強地激活NFκB。 本研究首次揭示了MMP3進入細胞核發(fā)揮抗病毒效應(yīng)的全新功能，為MMP家族參與免疫調(diào)控提供新的證據(jù)，而且MMP3分子的表達水平有可能成為登革熱疾病進程的診斷靶標，MMP3相關(guān)激動劑也將有可能應(yīng)用到抗病毒感染的應(yīng)用當中。
[Abstract]:Dengue virus is one of the most widely distributed insect-borne viruses in the world. It is mainly transmitted by Aedes aegypti and Aedes albopictus, which bite people. According to WHO estimates, millions of new dengue virus infections occur every year in the world. At present, the mechanism of dengue virus infection is still unclear, due to the lack of effective cross-protection among the serotypes, and the enhancement of antibody dependence. So far, there is no safe and effective vaccine available. Therefore, it is important to study the molecular mechanism of host versus dengue virus in understanding the pathogenesis of dengue fever. Our laboratory studies the molecular mechanism of host cells against dengue virus infection from the JAK-STAT signaling pathway. Highlights include matrix metalloproteinase 3 (MMP3). We studied the specific role of several downstream JAK-STAT effectors in anti-dengue virus infection before and after dengue virus infection in macrophages. The expression changes of 84 JAK-STAT related genes. The results showed that the expression of matrix metalloproteinase MMP3 increased by 3.68 times. In order to further verify the results of PCR chip. We also demonstrated that the expression of MMP3 in dengue virus infected cells was upregulated by quantitative PCR, and the expression of MMP3 was inhibited, and the level of viral infection was significantly increased. Overexpression of MMP3 in RAW264.7 cells can inhibit the replication of dengue virus, which indicates that MMP3 has the effect of anti-dengue virus infection. In order to understand the molecular mechanism of MMP3 antivirus, we detected the expression of representative antiviral cytokines in MMP3 silenced cells and control cells after dengue virus infection. In the silenced cells of MMP3. The expression of antiviral related cytokines and chemokines decreased significantly. Immunofluorescence showed that MMP3 migration from cytoplasm to nucleus occurred in dengue virus infected cells. The results of double luciferase reporter gene detection showed that the transcription activity of MMP3NF-kappa B was down-regulated in virus-infected cells. Overexpression of MMP3 can strongly activate NF 魏 B. in view of these results. We speculate that MMP3 may affect the transcription activity of NF 魏 B by entering the nucleus to achieve antiviral effect. In subsequent experiments, MM was obtained by fluorescence localization and immunoprecipitation. P3 and NF 魏 B interact with each other in dengue virus infected cells. MMP3 consists of five domains: signal domain, prepeptide domain, catalytic domain, hinge domain and carboxyl terminal domain. We constructed the plasmids containing various domains of MMP3 and associated with two subunits of NF 魏 B, P50; P65). Cotransfection of 293T cells was carried out by immunoprecipitation assay. The results showed that MMP3 mainly depended on the interaction between its carboxyl terminal domain and NF 魏 B. The carboxyl terminal domain of MMP3 can activate NF 魏 B more strongly. This study revealed for the first time that MMP3 enters the nucleus to play a new role in antiviral effect, providing new evidence for MMP family to participate in immune regulation. Moreover, the expression level of MMP3 may become a diagnostic target for dengue disease progression. MMP3 related agonists may also be used in antiviral infection.
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R512.8

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本文編號：1455735