本文關(guān)鍵詞：巨噬細(xì)胞抗艾滋病毒的天然免疫機(jī)制　出處：《武漢大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：宿主天然免疫反應(yīng)在控制病毒感染中發(fā)揮了重要作用。巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞。巨噬細(xì)胞在艾滋病毒(HIV和SIV)感染的發(fā)病機(jī)制中的重要性體現(xiàn)在其雙重作用：一方面它參與宿主的抗HIV免疫反應(yīng)；另一方面它是HIV的主要靶細(xì)胞和潛藏庫。由于HIV可整合于宿主細(xì)胞的DNA內(nèi),清除靶細(xì)胞中的HIV是治愈HIV感染的關(guān)鍵。大量研究表明,HIV能抑制宿主細(xì)胞的抗病毒信號途徑,造成慢性持續(xù)感染。因此,激活被HIV抑制的靶細(xì)胞內(nèi)的抗病毒免疫機(jī)制有助于控制和清除病毒。宿主細(xì)胞抗病毒天然免疫反應(yīng)主要依賴于天然免疫受體家族,如可識別HIV的TLR3(Toll-Like Receptor3)和RIG-I (Retinoic Acid-Inducible Gene-I)。TLR3和RIG-I的激活引起的免疫防御反應(yīng)能抑制病毒感染。本項目重點探討了TLR3和RIG-I激活巨噬細(xì)胞對艾滋病毒的抑制作用和機(jī)制。鑒于恒河猴已被廣泛用于艾滋病毒感染動物模型,本課題研究了恒河猴巨噬細(xì)胞中由TLR3或RIG-I誘導(dǎo)抗SIV和SHIV的天然免疫機(jī)制。 1.恒河猴巨噬細(xì)胞培養(yǎng)方法的研究 由于缺乏分離和培養(yǎng)恒河猴巨噬細(xì)胞的有效方法。本課題的首要工作是建立一種簡單、經(jīng)濟(jì)、高效地培養(yǎng)中國恒河猴(Macaca mulatta)外周血單核巨噬細(xì)胞(monocyte-derived macrophage, MDM)的方法。將猴外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)用含不同百分比的猴自體血清或胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后洗棄未貼壁細(xì)胞,加入含有猴自體血清或FBS的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天后觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)。在含2%猴自體血清的RPMI1640培養(yǎng)條件下,大多數(shù)(85%)猴單核細(xì)胞能在24h內(nèi)貼壁,體外分化5-7天后,恒河猴巨噬細(xì)胞的純度大于96%。分化良好的猴單核巨噬細(xì)胞貼壁能力強,占據(jù)板底大部分區(qū)域,胞體形態(tài)多樣,多數(shù)呈長梭形；對LPS刺激敏感,可產(chǎn)生多種巨噬細(xì)胞炎性因子。分化良好的猴巨噬細(xì)胞對SIV或SHIV均易感,可產(chǎn)生感染性病毒。因此,含2%猴自體血清的RPMI1640培養(yǎng)基適于原代猴單核細(xì)胞的貼壁和分化。該方法操作簡單,花費少,無需生長因子,且細(xì)胞分化效果好。 2.SIV感染中國恒河猴的天然免疫反應(yīng) 天然免疫受體TLR3和RIG-I在控制HIV/SIV感染中發(fā)揮重要作用。胞內(nèi)抗病毒因子,APOBEC3G(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide3G, A3G)、A3F、A3B和A3C,及四種miRNAs (miR-29a、29b、-146a和-9)具有抑制SIV感染和復(fù)制的功能。本課題利用SIV感染中國恒河猴模型研究了這些抗病毒因子在感染初期的時序性表達(dá)特點。使用SIVmacR71和SIVmac17E-Br毒株通過靜脈途徑感染4只中國恒河猴,4只猴均出現(xiàn)病毒血癥,并在腦脊液(Cerebrospinal Fluid, CSF)中檢測到高拷貝的SIV。SIV感染初期,被感染猴的天然免疫被顯著激活,并誘導(dǎo)產(chǎn)生多種抗病毒因子。與未感染之前狀態(tài)相比,SIV感染猴PBMCs的天然免疫受體(TLR3、RIG-I和MDA5),干擾素誘導(dǎo)因子(MxA、OAS-1),胞內(nèi)抗病毒因子(A3B、A3C、A3F和A3G)及抗SIV miRNAs-CmiR-29a、-29b、-146a和-9)在感染后第7天和第14天均有顯著增加,表明天然免疫反應(yīng)及其誘導(dǎo)因子在早期控制SIV復(fù)制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。急性病毒血癥期,上述四種miRNAs和四種APOBEC3的表達(dá)增加與OAS-1的表達(dá)呈平行升高趨勢。因OAS-1是干擾素途徑活化的標(biāo)志性細(xì)胞因子,所以提示在感染早期,上述具抗SIV功能的miRNAs和APOBEC3的表達(dá)受干擾素信號途徑的調(diào)節(jié)。本課題的上述研究結(jié)果表明,SIV感染的宿主體內(nèi)TLR3/RIG-I介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)在感染早期控制病毒復(fù)制和擴(kuò)散中具有重要作用。 3.激活TLR3信號途徑可抑制SIV在猴巨噬細(xì)胞中的復(fù)制 TLR3能夠識別dsRNA并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)抗病毒天然免疫反應(yīng)。本課題的研究發(fā)現(xiàn),poly I:C激活恒河猴巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR3信號途徑抑制SIV的感染和復(fù)制。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明,激活TLR3能夠誘導(dǎo)I型和III型干擾素及干擾素誘導(dǎo)的抗病毒因子的表達(dá),包括MxA、A3G和tetherin。另外,poly I:C刺激的恒河猴巨噬細(xì)胞p趨化因子(CCL3、CCL4和CCL5)表達(dá)水平升高。CCL3、CCL4和CCL5是HIV/SIV入胞輔助受體CCR5的配體,可競爭性抑制病毒進(jìn)入靶細(xì)胞。激活的巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生4種miRNAs (miR-29a、-29b、-146a和-9),是新近證實的胞內(nèi)SIV抑制因子。本課題的研究發(fā)現(xiàn),TLR3信號途徑激活恒河猴巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)miR、-29a、-29b和-146a的表達(dá)。而敲減IRF3或IRF7的表達(dá)能減弱由TLR3激活介導(dǎo)的抗SIV效應(yīng),說明IRF3和IRF7是TLR3信號途徑的激活誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素的重要調(diào)控因子。這些研究結(jié)果表明,由TLR3介導(dǎo)的下游信號的激活,并誘導(dǎo)產(chǎn)生的多種抗病毒因子,在病毒入胞和復(fù)制的不同階段抑制SIV在恒河猴巨噬細(xì)胞中的復(fù)制。 4.激活RIG-I信號途徑抑制SIV的復(fù)制 RIG-I信號途徑在激活I(lǐng)型干擾素依賴的抗病毒天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要功能。本課題的結(jié)果表明,人工合成的RIG-I配體(5'ppp-dsRNA)激活恒河猴巨噬細(xì)胞的RIG-I信號途徑能抑制SIV和SHIV的復(fù)制。進(jìn)一步機(jī)制研究表明,5'ppp-dsRNA激活的恒河猴巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平的RIG-I,并產(chǎn)生I型和Ⅲ型干擾素,干擾素信號途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子IRF3和IRF7也顯著上升。此外,激活RIG-I能夠誘導(dǎo)多種胞內(nèi)SIV限制因子(OAS-1、ISG56、MxA、tetherin、SAMHD1、A3G、和A3F)的表達(dá),這些限制因子的表達(dá)是5'ppp-dsRNA刺激恒河猴巨噬細(xì)胞抑制SIV復(fù)制的關(guān)鍵因子。 綜上所述,在建立了適合于體外培養(yǎng)分化猴單核巨噬細(xì)胞的方法基礎(chǔ)上,本課題重點研究了恒河猴巨噬細(xì)胞和SIV感染的相互關(guān)系。SIV感染可激活TLR3和RIG-I信號途徑,誘導(dǎo)產(chǎn)生多種抗病毒因子,這些因子在控制艾滋病毒復(fù)制中發(fā)揮了重要作用。本課題的進(jìn)一步研究證實,激活TLR3和RIG-I信號途徑可抑制恒河猴巨噬細(xì)胞中SIV復(fù)制,其分子機(jī)制是激活了Ⅰ型和Ⅲ型干擾素途徑,導(dǎo)致產(chǎn)生多種抗艾滋病毒因子,這些因子在病毒入胞和轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮抑制作用。在艾滋病毒入胞水平,巨噬細(xì)胞分泌的β趨化因子(CCL3、CCL4和CCL5)阻止艾滋病毒進(jìn)入靶細(xì)胞；在胞內(nèi)水平,TLR3/RIG-I激活的巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生多種艾滋病毒復(fù)制的限制因子,如A3G、tetherin、ISGs以及miRNAs,這些限制因子在艾滋病毒復(fù)制的不同時段抑制病毒,使病毒很難產(chǎn)生拮抗性突變。因此,激活TLR3/RIG-I信號途徑有助于有效地控制艾滋病毒感染和復(fù)制。本課題的結(jié)果為研發(fā)以激活靶細(xì)胞內(nèi)抗病毒天然免疫為基礎(chǔ)的艾滋病毒新療法提供了科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R512.91

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本文編號：1438342