發(fā)布時間：2018-01-16 00:35

  本文關鍵詞：miR-1273g-3p在HCV相關肝纖維化中的作用及調控機制研究　出處：《河北醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是慢性肝臟疾病的主要病因。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全球約有1.85億丙型肝炎病毒感染者,感染率約3%。我國的HCV感染率呈逐年上升,2013年報告病例數(shù)超過22萬人。前瞻性研究顯示80%的急性丙型肝炎患者可進展為慢性感染,HCV感染20-30年后,可導致肝硬化,肝衰竭及肝細胞癌。據(jù)估計到2025年,HCV相關的死亡率將增加3倍,是引起慢性肝臟疾病死亡的重要原因之一,嚴重危害人類健康。肝纖維化作為慢性HCV感染進展為肝硬化、肝衰竭及肝細胞癌的重要病理過程。因此,肝纖維化的早期診斷及有效的抗纖維化治療是阻止該病進展的重要措施。目前肝穿刺組織病理學檢查是診斷肝纖維化分期的金標準,但由于標本量限制及有創(chuàng)性,不適宜反復進行,且部分患者不易接受。因此,迫切需要探尋準確判斷肝纖維化分期及進展的分子生物學標志物。微小RNAs(microRNAs,miRNAs/miR)是一類內源性非編碼單鏈小RNA,可通過與靶mRNA的3'端非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)結合,抑制mRNA翻譯,對基因轉錄后水平進行負性調控。miRNAs參與體內正常細胞的生長、分化及增殖。大量研究表明miRNAs可參與細胞外基質成分的沉積及調節(jié)纖維化相關的信號通路。特異性阻斷或促進相關miRNAs表達可能逆轉肝纖維化的形成。因此,差異表達的miRNAs在HCV相關肝纖維化中的作用及分子機制有待進一步研究。本研究采用慢性HCV感染病例及建立HCV相關肝纖維化細胞模型,觀察差異表達miRNAs與HCV相關肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關系,預測其靶基因及主導信號轉導通路,闡明靶向調節(jié)miRNAs及其靶基因在HCV相關肝纖維化中的作用及分子機制,并進一步通過臨床病例驗證差異表達miRNAs對丙型肝炎肝纖維化分期的診斷價值,以為該病早期診斷提供敏感、特異的新型分子診斷標志物,為臨床上從基因水平診斷及防治該病提供新途徑及科學依據(jù)。第一部分hcv相關肝纖維化患者血清差異表達mirna的篩選、驗證及靶基因預測目的:篩選hcv相關肝纖維化患者血清中差異表達的mirnas,驗證及靶基因預測。方法:選擇河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院的慢性hcv感染者61例,另選與性別、年齡匹配的健康體檢者20例作為對照組,留取血清備用。慢性hcv感染者均由血清學及肝組織病理學確診,根據(jù)metavir評分系統(tǒng)將hcv患者分為輕度纖維化組(f2,n=27)和中至重度纖維化組(2≤f4,n=34)。另選5例肝移植供體作為健康對照組。血清丙氨酸氨基轉移酶(alanineaminotransferase,alt)及天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartateaminotransferase,ast)水平采用酶法檢測;肝組織切片行蘇木素-伊紅(haematoxylinandeosin,he)染色及masson三色染色,觀察肝組織纖維化程度;采用lcsciencesmicrorna基因表達譜芯片篩選hcv相關肝纖維化差異表達mirnas,采用實時定量pcr進行驗證;原位雜交方法檢測肝組織中mirna的表達情況;采用生物信息學3種軟件對mirna的靶基因進行共同預測,并用雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證。結果:1一般情況:健康對照組(n=20),其中男性8例,女性12例,平均年齡(48±9.7)歲;hcv感染患者f2組(n=27),其中男性11例,女性16例,平均年齡(47.44±11.8)歲;hcv感染患者2≤f4組(n=34),其中男性15例,女性19例,平均年齡(52.40±7.8)歲。三組年齡之間差異無統(tǒng)計學意義(f=2.006,p=0.141)。2血清alt、ast水平:健康對照組、hcv感染患者f2組及hcv感染患者2≤f4組血清alt中位數(shù)分別為25.5、48、31u/l,三組之間差異具有統(tǒng)計學意義(z=6.262,p=0.044);血清ast中位數(shù)分別為23.5、38、44u/l,三組之間差異具有統(tǒng)計學意義(z=29.511,p=0.000)。兩兩比較結果顯示,hcv感染患者f2組、2≤f4組血清alt顯著高于健康對照組(p=0.032,p=0.005);hcv感染f2組、2≤f4組患者血清ast均顯著高于健康對照組(均p=0.000)。3肝組織病理學特征:健康對照組肝小葉結構正常,hcv感染者f2組肝組織可見肝細胞輕度水樣變,竇周輕度纖維化,少量纖維化組織增生;2≤f4組可見肝細胞中至重度水樣變,可見竇周纖維化;匯管區(qū)擴大,纖維組織增生明顯,纖維間隔形成。4mirnas芯片結果:采用mirnas芯片篩選hcv相關肝纖維化患者血清中差異表達的mirnas,篩選出41個差異表達mirnas,其中表達上調的有30個(has-mir-7977,has-mir-1273g-3p等),下調的有11個(has-mir-191-5p,has-mir-4289等)。5mirnas的驗證及相關性分析:應用實時定量pcr方法檢測,結果顯示hcv相關肝纖維化患者血清中mir-1273g-3p表達較對照組明顯上調,與芯片結果一致(p0.05),sperman相關分析mir-1273g-3p與肝纖維化分期呈正相關(r=0.601,p=0.000)。應用原位雜交技術檢測到hcv相關肝纖維化肝組織中mir-1273g-3p表達隨著肝纖維化的進展其表達明顯增多。6mir-1273g-3p的靶基因預測:應用3種靶基因預測軟件預測mir-1273g-3p的靶基因,其中10號染色體缺失性磷酸酶張力蛋白同原物基因(phosphataseandtensinhomologydetetedonchromosometen,pten)3'utr區(qū)存在mir-1273g-3p的結合位點并應用雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證。結論:1hcv相關肝纖維化患者血清中mirnas差異表達明顯,提示mirnas可能參與了該病的進展。2血清mir-1273g-3p在hcv相關肝纖維化患者表達較正常組明顯上調,并在中至重度肝纖維化患者進一步升高,且與肝纖維化分期呈正相關。3mir-1273g-3p能與pten特異性結合,提示pten為mir-1273g-3p的靶基因。第二部分mir-1273g-3p在體外活化肝星狀細胞中的表達變化目的:建立穩(wěn)定表達hcv核心蛋白的hepg-core細胞系,探明mir-1273g-3p在肝星狀細胞(hepaticstellatecell,hsc)活化中的作用。方法:將pcdna3.1-hcv核心蛋白質粒轉染至hepg2細胞,構建穩(wěn)定表達hcv核心蛋白的hepg2-core細胞系并用實時定量pcr和westernblot進行驗證;酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測hepg2細胞上清液中轉化生長因子β1(transforminggrowthfactorβ1,tgf-β1)水平。將細胞培養(yǎng)上清液作為條件培養(yǎng)基處理人肝星狀細胞系lx-2,檢測lx-2中mir-1273g-3p及靶基因pten的表達變化;實時定量pcr,westernbolt及免疫細胞熒光染色方法檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscleactin,α-sma)、?型膠原α1(alpha-1typeicollagen,col1a1)及tgf-β1表達;細胞增殖-毒性檢測試劑盒(cellcountingkit8,cck-8)檢測細胞增殖情況;流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況。結果:1成功建立穩(wěn)定表達hcv核心蛋白的hepg2-core細胞系:與對照hepg2-nc細胞相比,hepg2-core細胞能夠穩(wěn)定表達hcvcoremrna和蛋白;培養(yǎng)上清液中tgf-β1水平顯著升高。2hepg2-core細胞培養(yǎng)上清液作為條件培養(yǎng)基可促進hsc活化及增殖,抑制其凋亡:hepg2-core細胞培養(yǎng)上清液促進lx-2細胞α-sma、col1a1及tgf-β1mrna及蛋白表達顯著增加,促進lx-2細胞的活化及增殖,抑制lx-2細胞的凋亡。3在活化的hsc中,mir-1273g-3p表達顯著增加,靶基因pten表達顯著下調:mir-1273g-3p在表達hepg2-core細胞培養(yǎng)上清液誘導活化的hsc中表達顯著上調,靶基因pten隨著hsc的活化其表達顯著減少。結論:1穩(wěn)定表達hcv核心蛋白的hepg2-core細胞上清液可作為條件培養(yǎng)基促進lx-2細胞活化及增殖,抑制其凋亡。2mir-1273g-3p在活化的hsc中升高,靶基因pten表達下調。第三部分靶向調控mir-1273g-3p及靶基因pten對肝星狀細胞活化的影響及作用機制目的:明確過表達及抑制mir-1273g-3p及其過表達靶基因pten對活化hsc的影響及分子生物學機制。方法:應用肝星狀細胞系lx-2細胞,將50μmmir-1273g-3pmimic、100μminhibitor及各自的對照組,過表達載體pten及對照組轉染至lx-2細胞;采用cck-8測定各組細胞活力,采用實時定量pcr及westernblot檢測mir-1273g-3p,靶基因pten及下游信號因子,肝纖維化相關基因的表達情況。結果:1抑制或過表達mir-1273g-3p對hsc活化、增殖及凋亡的影響:抑制mir-1273g-3p能夠顯著抑制α-sma、col1a1及tgf-β1mrna及蛋白的表達;cck-8結果顯示,轉染100μmmir-1273g-3pinhibitor后,lx-2的細胞活力明顯降低;pi標記的流式細胞儀檢測,應用mir-1273g-3p抑制劑后,lx-2的細胞凋亡率明顯增多。過表達mir-1273g-3p后上述結果呈相反趨勢。2抑制或過表達mir-1273g-3p對靶基因pten、下游信號通路因子及纖維化因子的影響:抑制mir-1273g-3p后,靶基因pten的蛋白表達明顯增多,mrna的表達無明顯差異;其下游akt的表達明顯減少;促凋亡指標bad、bax、caspase9/3及parp的表達明顯增多,抗凋亡指標bcl-2的表達明顯減少。過表達mir-1273g-3p后,靶基因pten的表達明顯減少,下游因子akt的表達明顯增多,促凋亡指標bad、bax、caspase9/3及parp的表達明顯減少,抗凋亡指標bcl-2的表達明顯增多。3過表達靶基因對pten、下游信號通路因子及肝纖維化因子的影響:過表達pten后,pten的表達水平明顯上調,同時下游基因akt的mrna水平及p-akt蛋白水平表達下調;促凋亡指標bad、bax、caspase9/3及parp的表達顯著上調,抗凋亡因子bcl-2表達水平下調;肝纖維化因子α-sma、col1a1及tgf-β1的表達水平表達明顯減少,lx-2細胞的凋亡率明顯增加。結論:1抑制mir-1273g-3p能夠減少hsc的活化、增殖及膠原分泌,促進hsc的凋亡。2抑制mir-1273g-3p能夠上調hsc內靶基因pten的表達,抑制下游因子akt的表達,進而促進hsc凋亡。3過表達pten可抑制hsc的活化及增殖,促進hsc的凋亡。第四部分mir-1273g-3p對丙型肝炎肝纖維化分期的診斷價值目的:對比分析mir-1273g-3p、lsm、arpi及fib-4與肝纖維化分期的相關性及受試者曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve,roc)下面積,明確mir-1273g-3p診斷丙型肝炎肝纖維化分期的價值。方法:肝穿證實慢性丙型肝炎患者112例,均于肝穿前后1周,同步檢測肝臟生化、外周血小板計數(shù)及fibrotouch檢測肝臟硬度值(liverstiffnessmeasurement,lsm),根據(jù)metavir纖維化評分系統(tǒng)分成3組(f229例,2≤f447例,f=426例),外周血血小板(platelet,plt)采用自動五分類血細胞分析儀檢測;采用olympus全自動生化分析儀檢測肝臟生化指標;apri和fib-4指數(shù)按公式進行計算;spearman分析mir-1273g-3p、lsm、apri和fib-4與肝組織病理學分期的相關性;采用roc曲線對比分析mir-1273g-3p、lsm、apri和fib-4診斷不同纖維化分期的診斷效能。結果:1患者的一般情況:慢性丙型肝炎患者112例,f2組39例,其中男性17例,女性22例,平均年齡(43±12.42)歲;2≤f4組47例,其中男性22例,女性25例,平均年齡(52.29±9.54)歲;f=4組26例,其中男性17例,女性9例,平均年齡(55.19±10.18)歲,三組之間年齡的差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=12.294,p=0.000),兩兩比較結果顯示,2≤f4組及f=4組間年齡無顯著性差異(p=0.274),但高于f2組(p值均為0.000)。2血清酶學水平:f2組、2≤f4組及f=4組血清alt中位數(shù)為31.5、33、38.4u/l,三組之間alt差異無統(tǒng)計學差異(χ2=1.604,p=0.199);f2組、2≤f4組及f=4組血清ast中位數(shù)為34、39、48.5u/l,三組之間ast差異無統(tǒng)計學差異(χ2=1.175,p=0.245);f2組、2≤f4組及f=4組血清tbil中位數(shù)為12.7、13.9、17.31μmol/l,三組之間tbil差異有統(tǒng)計學差異(χ2=5.603,p=0.035),f=4組血清tbil中位數(shù)高于f2組、2≤f4組(p=0.002,p=0.004);f2組、2≤f4組及f=4組血清plt中位數(shù)為183×109/l,149.6×109/l,125×109/l,三組之間plt差異有統(tǒng)計學差異(χ2=13.518,p=0.000),f=4組及2≤f4組血清plt水平低于f2組(p=0.001,p=0.000);f=4組血清plt水平低于2≤f4組(p=0.021)。3mir-1273g-3p、lsm、fib-4及apri與丙型肝炎肝纖維化分期的相關性:以肝組織病理學分期為依據(jù),spearman相關分析了血清mir-1273g-3p的表達與肝纖維化的分期呈正相關(r=0.657),lsm,apri和fib-4與肝組織病理學也顯出很好的相關性(r=0.815,0.417,0.522)。4對比分析mir-1273g-3p,lsm,fib-4及apri對丙型肝炎肝纖維化分期的診斷價值及影響因素:ROC下面積結果顯示miR-1273g-3p診斷肝纖維化分期S≥2,S=4的ROC曲線下面積分別為(0.841,0.933),明顯高于FIB-4(0.791,0.766)和APRI(0.719,0.760),低于LSM(0.890,0.937)。Spearman相關分析顯示:miR-1273g-3p與年齡,體重指數(shù),ALT,AST及TBIL呈正相關,相關系數(shù)r分別為0.396,0.219,0.215,0.228及0.225(P0.05),與PLT呈負相關r=-0.318(P0.05)。結論:1血清miR-1273g-3p與肝纖維化的病理分期呈正相關。2血清miR-1273g-3p對明顯肝纖維化及早期肝硬化的診斷有較高的價值。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R512.63;R575.2

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本文編號：1430809