本文關(guān)鍵詞：鉤蟲(chóng)病患者血清對(duì)美洲鉤蟲(chóng)抗原反應(yīng)性分析及美洲鉤蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建　出處：《中國(guó)疾病預(yù)防控制中心》2016年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：鉤蟲(chóng)病仍在我國(guó)廣大農(nóng)村流行,嚴(yán)重危害人民健康,是重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。有效的診斷方法對(duì)于此病的防治非常關(guān)鍵,糞檢法仍是目前最普遍應(yīng)用的診斷方法。隨著防治工作的深入,人群感染率和感染度降低,此方法已不能滿(mǎn)足防治工作需要,迫切需要快速簡(jiǎn)便的免疫學(xué)檢測(cè)方法應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模篩查或診斷,而診斷抗原是建立有效免疫學(xué)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)。本研究以美洲鉤蟲(chóng)成蟲(chóng)為材料,對(duì)其應(yīng)用不同方法進(jìn)行處理,得到四種可溶性粗抗原(分別記為A、B、C和D抗原),應(yīng)用ELISA法對(duì)其檢測(cè)效能進(jìn)行評(píng)價(jià),并選取檢測(cè)效能較高的抗原應(yīng)用于鉤蟲(chóng)病人血清抗體反應(yīng)性分析,以確定鉤蟲(chóng)病人血清中優(yōu)勢(shì)抗體(亞)類(lèi),從而為建立敏感特異檢測(cè)鉤蟲(chóng)病的免疫檢測(cè)方法提供依據(jù)；另外,本研究通過(guò)Gateway技術(shù)構(gòu)建鉤蟲(chóng)cDNA入門(mén)文庫(kù)和表達(dá)文庫(kù),將應(yīng)用確診的鉤蟲(chóng)病人混合血清對(duì)cDNA表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選,并對(duì)篩選到的基因進(jìn)行序列分析和編碼蛋白分析；誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,應(yīng)用ELISA方法對(duì)重組蛋白的診斷價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)。分別以制備的A、B、C、D四種美洲鉤蟲(chóng)成蟲(chóng)可溶性粗抗原作為包被抗原,以酶標(biāo)記抗人IgG作為二抗,以ELISA法檢測(cè)鉤蟲(chóng)病患者血清、健康入和其它寄生蟲(chóng)病患者血清,其檢測(cè)的敏感性分別為87.75%、86.73%、87.75%和93.87%；特異性分別為76.12%、74.63%、73.13%和80.60%；診斷效能分別為83.03%、81.82%、81.82%和88.48%。表明D抗原具有很好的免疫檢測(cè)效能。選取診斷效能較高的D抗原作為包被抗原,分別以酶標(biāo)記抗人IgM、IgD、IgE、IgG1、 IgG2、IgG3、IgG4和IgG作為二抗,以ELISA法檢測(cè)鉤蟲(chóng)病患者血清,其檢測(cè)的敏感性依次為41.84%、2.04%、1.02%、19.39%、25.51%、17.35%、88.78%和92.93%；檢測(cè)健康人和其它寄生蟲(chóng)病患者血清的特異性依次為77.61%、97.01%、92.54%、95.52%、92.53%、92.53%、92.53%和79.10%；診斷效能依次為56.36%、40.61%、38.18%、50.30%、52.73%、47.88%、90.30%和87.88%。表明IgG4和IgG是鉤蟲(chóng)病血清中優(yōu)勢(shì)抗體(亞)類(lèi)。本研究使用美洲鉤蟲(chóng)成蟲(chóng)為材料構(gòu)建了美洲鉤蟲(chóng)cDNA入門(mén)文庫(kù),其平均滴度為3.0×1O5cfu/ml,庫(kù)總?cè)萘繛?.0×105cfu；基于構(gòu)建的入門(mén)文庫(kù)構(gòu)建了美洲鉤蟲(chóng)成cDNA表達(dá)文庫(kù),其平均滴度為1.9×104cfu/ml,總?cè)萘繛?.9×104cfu,平均插入片段大小為1010kb,重組率為85%。應(yīng)用確診的鉤蟲(chóng)病人混合血清篩選cDNA文庫(kù),篩選出2個(gè)強(qiáng)陽(yáng)性克隆,經(jīng)測(cè)序和序列分析,S1插入片段長(zhǎng)度為1042bp,編碼的蛋白與已報(bào)道的美洲鉤蟲(chóng)β一微管蛋白高度同源(99%)；S2插入片段長(zhǎng)度為937bp,編碼的蛋白與已報(bào)道的美洲鉤蟲(chóng)一未知蛋白高度同源。對(duì)S1和S2編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè),表明兩者均具有很好的抗原性。然后對(duì)S1和S2編碼基因進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)和純化,對(duì)純化蛋白應(yīng)用ELISA法評(píng)價(jià)了它們的診斷效能,結(jié)果顯示S1和S2重組蛋白檢測(cè)的敏感性分別為88.42%和91.58%；特異性分別為77.27%和95.45%,二者檢測(cè)的診斷效能分別為83.85%和93.17%。這些結(jié)果表明,本項(xiàng)研究已成功構(gòu)建了美洲鉤蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA表達(dá)庫(kù),為篩選診斷靶分子提供了基礎(chǔ)；篩選出的S2重組蛋白顯示了很好的診斷潛能,經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究有望開(kāi)發(fā)出檢測(cè)鉤蟲(chóng)病的試劑盒。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R532.12

【參考文獻(xiàn)】

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1 許隆祺;陳穎丹;孫鳳華;蔡黎;方悅怡;王麗萍;劉新;李莉莎;馮宇;李輝;;全國(guó)人體重要寄生蟲(chóng)病現(xiàn)狀調(diào)查報(bào)告[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志;2005年S1期

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本文編號(hào)：1352677