本文關(guān)鍵詞：升高核糖核酸酶H活性對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥效學的影響　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：逆轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription)是HIV-1生命周期重要環(huán)節(jié),即病毒感染CD4+細胞以其自身基因組RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄生成雙鏈DNA的過程,該過程由HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase, RT)催化。RT有三種酶活性：RNA依賴的DNA聚合酶(RNA Dependent DNA Polymerase, RDDP)活性,DNA依賴的DNA聚合酶(DNA Dependent DNA Polymerase, DDDP)活性和水解RNA/DNA雜交雙鏈中模板RNA的核糖核酸酶H (Ribonuclease H, RNase H)活性,三種酶活性協(xié)調(diào)進行共同完成逆轉(zhuǎn)錄過程。RT是抗艾滋病藥物經(jīng)典靶點,目前已上市12種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑,包括7種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors, NRTIs)和5種非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors, NNRTIs),均為逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶抑制劑,患者長期服用后會產(chǎn)生耐藥病毒導致治療失敗。至今臨床尚無作用于逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H的藥物,因此對新靶點RNaseH的研究,對耐藥HIV治療有重要意義。HIV逆轉(zhuǎn)錄是一個復雜而有序的過程,由逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶活性與RNase H活性協(xié)調(diào)催化。現(xiàn)有抗艾滋病治療方法中,DNA聚合酶抑制劑是首選藥物。本論文欲研究的科學問題是：若使用DNA聚合酶抑制劑的同時升高RNase H活性,加劇破壞兩種酶活性平衡,是否可達到更優(yōu)抗HIV效果。本論文試圖通過不同方法提高RNase H活性,然后研究RNase H活性提高時NRTIs和NNRTIs單獨及聯(lián)合使用的藥效學�？疾焐逺Nase H活性對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑抗HIV-1體外藥效學的影響。論文嘗試兩種方法提高RNase H活性：尋找RNase H激動劑和高RNase H活性突變逆轉(zhuǎn)錄酶。首先通過文獻檢索和試驗,試圖發(fā)現(xiàn)可升高RNase H活性的化合物,結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有RNase H激動劑報道；然后我們通過檢索確認了33個用于臨床的抗病毒藥物,并進行了RNase H活性評價試驗,亦未發(fā)現(xiàn)RNase H激動劑。在尋找RNase H激動劑的同時,我們還試圖尋找RNase H活性升高的逆轉(zhuǎn)錄酶。通過查閱大量文獻,尚無高RNase H活性突變逆轉(zhuǎn)錄酶的報道。因此,本研究將文獻檢索重點轉(zhuǎn)向艾滋病臨床病例報道,關(guān)注臨床分離并測序的HIV突變毒株,最終確定了6個突變毒株,這些毒株具備如下特點：①為臨床分離病毒,因此其保留了RT功能,即有DNA聚合酶活性和RNase H催化活性；②由于所確定的臨床分離株不耐藥,說明NNRTIs和NRTIs與RT p66亞基結(jié)合能力無較大改變,推論RT聚合酶活性變化較�。虎鄞_定的分離株中RNase H存在突變,該突變可能造成RNase H活性改變,即有活性升高的可能。本研究采用分子克隆技術(shù)將相應(yīng)突變位點引入野生型HIV-1 RT表達質(zhì)粒(p6HRT-Pr)中,構(gòu)建上述6個突變HIV-1毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶表達質(zhì)粒：RT5326、RT5329、RT5512、RT5331、RT6316和RT6853(注：下標為病例號)。然后,應(yīng)用PDMI和p6HRT-Pr雙質(zhì)粒表達體系將野生和6個突變毒株逆轉(zhuǎn)錄酶原核表達,并應(yīng)用鎳離子親和層析法分離純化,再用熒光測定法和酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)分別測定RTwt和6個突變逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性和RDDP活性。結(jié)果顯示其中5個突變逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活性下降或無明顯變化,只有RT5329 (RTN460D/T468S/K530R/A554T/V5591) RNase H活性升高約20%,RDDP活性降低約6%,初步確定將從5329病例分離得到的突變HIV-1毒株用于后續(xù)研究。然后本論文合成了5329突變毒株RNase H基因,再通過酶切連接將其替換入HIV-1野生重組病毒基因HIV-1 (pNL4-3),獲得HIV-15329突變質(zhì)粒。然后采用改良磷酸鈣轉(zhuǎn)染法構(gòu)建野生型和5329突變毒株模式病毒,以VSVG/HIV-15329為實驗組,以VSVG/HIV-1wt為對照組,比較AZT、3TC和EFV以及聯(lián)合用藥對野生和突變重組病毒的藥效學,評價在細胞水平逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活性升高對現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑及其聯(lián)合用藥的藥效學影響。結(jié)果顯示,AZT、3TC (NRTIs)和EFV、NVP、ETR (NNRTIs)單個藥物抑制HIV-1wt和HIV-15329復制的半數(shù)抑制濃度無明顯差異；AZT/3TC/EFV聯(lián)合使用抑制HIV-1wt和HIV-15329復制,藥物間均表現(xiàn)為強協(xié)同作用,CI值均小于1分別為0.57和0.61,即AZT/3TC/EFV聯(lián)合用藥抗HIV-1wt體外藥效學略優(yōu)于抗HIV-15329體外藥效學。綜合分析,RNase H活性升高20%對聚合酶抑制劑單個藥物和聯(lián)合用藥藥效無明顯促進或拮抗作用,我們需要進一步研究升高RNase H活性對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄過程的影響,同時嘗試不同方法大幅度提高RNase H活性(100%)深入研究高RNaseH活性對聚合酶抑制劑藥效學及逆轉(zhuǎn)錄過程的影響。該研究對理解RNase H在HIV逆轉(zhuǎn)錄過程中的作用機制和耐藥HIV的藥物研發(fā)有一定參考價值。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.91

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本文編號：1315702