本文關鍵詞：中緬邊境惡性瘧原蟲對乙胺嘧啶等抗瘧藥的抗藥性研究

  更多相關文章： DHPS基因 DHFR基因 PFMRP1基因 抗藥性 DHFR基因 高濃度藥物篩選 抗藥性

【摘要】：第—部分 中緬邊境惡性瘧原蟲DHPS.DHFR.PFMRPl基因多態(tài)性研究目的：通過基因擴增技術,研究中緬邊境惡性瘧流行地區(qū)惡性瘧原蟲磺胺多辛抗性相關基因二氫蝶酸合成酶DHPS基因,乙胺嘧啶抗性相關基因二氫葉酸還原酶DHFR基因以及多藥物抗性相關蛋白PFMRP1基因,比較2008年與2012年單一感染病人株的抗藥性基因點突變、多重突變的差異。方法：提取上述樣本的DNA,應用巢式PCR(Nest-PCR)方法分別擴增單一感染株PFMRP1基因全長5469bp片段,DHPS基因包括436,437位密碼子的長為319bp片段以及540、581、613位密碼子在內(nèi)的長為472bp片段,DHFR基因包括16、51、59、108、164位密碼子在內(nèi)的長度為646bp片段,并進行測序,再與標準株3D7的序列進行比對,得出基因突變結果,對結果進行統(tǒng)計學分析。結果：1.DHPS基因擴增,28株病人株中,獲得319bp和472bp的片段,在已經(jīng)報道的436、437、540、581四個位點中,均發(fā)現(xiàn)點突變,突變型為S436A、A437G.K540E/N.A581G.突變率分別為：46.43％、100%、71.43%、50%。2008年突變率分別為60％、100％、80％、33.33%,2012年突變率分別為30.77%、100%、61.54%、69.23%。2.DHFR基因擴增,28株病人株中,獲得646bp的片段,在已經(jīng)報道的51、59、108、164四個位點中,均發(fā)現(xiàn)點突變,突變型為N51I、C59R、S108N、I164L。突變率分別為：64.29％、100%、100％、71.43%。2008年突變率分別為53.33％、100％、100％、80.33％；2012年突變率分別為76.92％、100％、100%、61.54%。3.PFMRP1基因擴增,28株病人株中,獲得此基因的全長5469bp片段,在已經(jīng)報道的191、325、437、785、876、1007、1390七個位點中,均發(fā)現(xiàn)點突變,突變型為H191Y、N325S、S437A、H785N、1876V、T1007M、F1390I。突變率分別為：75％、10.71％、64.29％、25％、57.14％、35.71％、14.29％。2008年突變率分別為66.67%、6.67％、60％、13.33％、60％、26.67%、20%；2012年突變率分別為84.62％、15.38％、69.23％、38.46％、53.85％、47.15％、7.69%。結論：中緬邊境2008年與2012年病人株的DHPS、DHFR、PFMRP1基因各位點的突變率進行比較,P值均大于0.05,都沒有顯著性差異。第二部分中緬邊境惡性瘧原蟲對乙胺嘧啶等五種抗瘧藥抗藥性的體外測定及與DHFR基因抗藥性的關聯(lián)分析研究目的：研究2008年與2012年中緬邊境惡性瘧原蟲單一感染病人株,進行甲氟喹、哌喹、氯喹、乙胺嘧啶、苯芴醇5個藥物敏感性的測定,分析不同年份病人株對不同藥物敏感性差異；并通過基因擴增技術,研究其與乙胺嘧啶抗藥性相關基因DHFR基因點突變情況,比較基因點突變與抗藥性的關聯(lián)。方法：1、對中緬邊境惡性瘧原蟲2008年份15株、2012年份13株共28株病人株,同步化后進行甲氟喹、哌喹、氯喹、乙胺嘧啶、苯芴醇5個藥物的抗藥性測定。2、應用Nest.PCR擴增DHFR基因上的片段進行測序,與標準株3D7的序列進行比對,得出基因突變結果,再與抗藥性進行關聯(lián)分析。結果：1、2008年中緬邊境惡性瘧原蟲病人株15株對甲氟喹、哌喹、氯喹、乙胺嘧啶、苯芴醇5種藥物ICso值測定分別為：56.87±29.79nM、13.85±8.901nM、1265 ±845.2nM、3055±2178nM、4.669±2.147nM:2012年中緬邊境惡性瘧原蟲病人株13株對氟喹、哌喹、氯喹、乙胺嘧啶、苯芴醇5種藥物ICs0值測定分別為：58.09±20.40nM、17.13±8.893nM、808.1±481.5 nM、2079±943.2nM、4.906±2.430mM。2、對中緬邊境惡性瘧原蟲2008年與2012年病人株的五種抗瘧藥物IC50值進行比較,P值均大于0.05,差異無統(tǒng)計學意義,則認為2008年與2012年病人株對這五種抗瘧藥物抗藥性無顯著性差異。3.DHFR基因突變位點突變率最高的為59、108位點,均為100%突變；統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),在位點51發(fā)生突變病人株與未發(fā)生突變病人株的乙胺嘧啶IC50比較,P=0.04400.05,兩組間的差異有統(tǒng)計學意義。4、28株的病人株中,DHFR基因的二重突變C59R、S108N有2株,其乙胺嘧啶IC50的均數(shù)為1743nM,三重突變N51I、C59R、S108N有6株,其乙胺嘧啶IC50的均數(shù)為2679nM,三重突變C59R、S108N、1164L有8株,其乙胺嘧啶IC50的均數(shù)為1926nM,四重突變N51I、C59R、S108N、I164L有12株,其乙胺嘧啶IC50的均數(shù)為3127nnM,發(fā)現(xiàn)四重突變組的乙胺嘧啶IC50值最高,二重突變組的乙胺嘧啶IC50值最低,但比較多重突變組之間的乙胺嘧啶IC50值,P=0.18190.05,無統(tǒng)計學意義。結論：1、本實驗的28株病人株中,甲氟喹敏感株6/28株,敏感性下降3.57%,表明該地區(qū)對甲氟喹仍具敏感性；哌喹敏感株4/28株,敏感性下降21.43%,表明該地區(qū)對哌喹產(chǎn)生了一定的抗性；氯喹全部為高抗性病人株,敏感性下降100%,表明該地區(qū)的惡性瘧原蟲對氯喹存在廣泛嚴重的抗藥性；乙胺嘧啶敏感株2/28株,敏感性下降71.43%,表明該地區(qū)對乙胺嘧啶已產(chǎn)生了相當嚴重的抗性；苯芴醇敏感株7/28株,敏感性下降42.86%,表明該地區(qū)對苯芴醇產(chǎn)生了比較嚴重的抗性。2、中緬邊境2008年與2012年病人株的五種抗瘧藥抗藥性無差異。3、DHFR基因51位點的突變與乙胺嘧啶抗藥性有相關關系。4、經(jīng)統(tǒng)計分析,不能認為DHFR基因多重突變與乙胺嘧啶抗藥性有相關關系,但是發(fā)生突變的病人株對乙胺嘧啶IC50值大于該位點沒有發(fā)生突變的病人株。第三部分高濃度藥物持續(xù)給藥篩選試驗目的：研究中緬邊境惡性瘧原蟲單一感染病人株對甲氟喹、青蒿琥酯、哌喹和雙氫青蒿素四個藥物持續(xù)加壓給藥,篩選出高抗株,并測定出高抗株在不同藥物濃度時期的IC50值,得出病人株在不同藥物濃度時期抗藥性的關系,比較此方法得出的數(shù)據(jù),推斷青蒿素類藥物與長效藥物產(chǎn)生抗性是否相同。方法：對中緬邊境惡性瘧原蟲鑒定出的單一感染株25株,即在前期工作中發(fā)現(xiàn)IC50值高于敏感標準株3倍以上的病人株,給予四個藥物：甲氟喹、青蒿琥酯、哌喹和雙氫青蒿素。使用已有ICso的2倍甚至是更高濃度藥物,進行病人株體外培養(yǎng),持續(xù)給藥,誘導病人株,達到某一個最高抗性藥物濃度作為結果,篩選出高濃度藥物下成活的病人株為目的病人株,進行不同藥物濃度的抗藥性測定。結果：1、中緬邊境惡性瘧原蟲病人株25株,共篩選出藥物AS病人株1株：F08B32,分別選取3個濃度為30nm,60nm,90nm進行抗藥性研究；DHA病人株2株：F08B41、F08B62,分別選取3個濃度為10nm,20nm,40nm進行抗藥性研究；MQ病人株1株：F09N64,分別復蘇濃度為0nm,70nm進行抗藥性研究,其中70nnm再復蘇未成活。2、對篩選出的病人株進行抗藥性測定,F08B32株的AS30nm,60nm,90nm三個濃度ICso分別為22.690±2.325nm、39.170±2.461nm、56.500±9.856nm:F08B41株的DHA10nm,20nm,40nm三個濃度IC50分別為5.462±0.666nm、8.304±0.225nm、14.540±1.954nm:F08B62株的DHA10nm,20nm,40nm三個濃度ICso分別為2.826±0.055nm、4.118±0.113nm、8.140±0.072nm、3、篩選所得病人株的每個藥物濃度進行比較,F08B32病人株的AS30nm/60nm/90nm組P=0.00140.05,差異有統(tǒng)計學意義,認為病人株F08B32青蒿琥酯三個藥物濃度,測得IC50值不同；F08B41病人株的DHA10nm/20nm/40nm組P=0.00020.05,差異有統(tǒng)計學意義,認為病人株F08B41雙氫青蒿素三個藥物濃度,測得ICso值不同；F08B62病人株的DHA10nm/20nm/40mn組P0.0001,差異有統(tǒng)計學意義,認為病人株F08B62雙氫青蒿素三個藥物濃度,測得ICso值不同；且由上可看出ICso值增加隨著藥物濃度的遞增而增加。結論：惡性瘧原蟲對雙氫青蒿素及青蒿琥酯兩個藥物的抗藥性隨藥物濃度的遞增而變大。
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R531.3

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊恒林,劉德全,董瑩,楊品芳,劉瑞君,詹斌,張春勇;體外測定惡性瘧原蟲對七種抗瘧藥的敏感性[J];中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志;1995年02期

，

本文編號：1290775