本文關(guān)鍵詞：利用G-CSF動員的PBMC制備的CMV-CTL治療異基因造血干細(xì)胞移植后HCMV感染的臨床研究

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【摘要】：人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)為β-皰疹病毒的一種,為雙鏈DNA病毒,具有種屬特異性,其在我國人群的潛伏感染率達(dá)到90%。HCMV首先感染樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)等抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC),但感染后病毒并不能被徹底清除,病毒可潛伏在某些特定的CD34+造血祖細(xì)胞內(nèi),在其向髓系細(xì)胞的分化過程中,潛伏的病毒也被保存下來[1]。當(dāng)宿主免疫功能低下時,潛伏的病毒可發(fā)生再次激活。異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)作為目前治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的方法已被廣泛應(yīng)用,雖然造血干細(xì)胞移植的發(fā)展使血液系統(tǒng)惡性腫瘤的生存率有明顯提高。但移植后相關(guān)并發(fā)癥仍為影響患者預(yù)后的主要因素,由于移植過程應(yīng)用致死劑量的放化療且移植后免疫抑制劑的應(yīng)用而使患者免疫功能顯著降低,導(dǎo)致移植后感染的發(fā)生率明顯增加,且移植早期發(fā)生感染會導(dǎo)致較高的致死率[2]。而HCMV作為長期潛伏在人體內(nèi)的機(jī)會致病菌,引起巨細(xì)胞病毒感染有很多移植相關(guān)危險因素。有研究分析得出清髓性預(yù)處理方案,巨細(xì)胞病毒感染前發(fā)生急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)為移植后HCMV初次激活的危險因素,而原發(fā)病為淋巴瘤或多發(fā)性骨髓瘤患者則為移植后連續(xù)HCMV感染的危險因素[3,4]。且有研究分析巨細(xì)胞病毒感染到巨細(xì)胞病毒感染性疾病發(fā)生的危險因素,得出最初發(fā)生巨細(xì)胞病毒感染時CMV拷貝數(shù)高,且監(jiān)測到CMV拷貝數(shù)時粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞缺乏為巨細(xì)胞病毒感染發(fā)展為巨細(xì)胞病毒感染性疾病的危險因素,其中淋巴細(xì)胞缺乏可作為獨立因素預(yù)測巨細(xì)胞病毒感染發(fā)展為巨細(xì)胞病毒感染性疾病的風(fēng)險[5]。雖然更昔洛韋及膦甲酸鈉對控制CMV感染有一定療效,但抗病毒藥物存在明顯的骨髓抑制及腎臟損傷,可以延遲患者CMV特異性免疫的恢復(fù),造成遲發(fā)型CMV感染的發(fā)生,且遲發(fā)型CMV感染的病死率較高,可達(dá)40%以上[6,7]。隨著細(xì)胞治療的發(fā)展,抗病毒的細(xì)胞治療成為了研究的熱點,而細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)作為抗病毒細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞成為了研究的焦點。近幾年,各中心探索不同的細(xì)胞制備方法,并進(jìn)行臨床試驗取得較好療效。目前制備巨細(xì)胞病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的方法主要為體外培養(yǎng),利用四聚體篩選,利用IFN-γ篩選等方法。體外培養(yǎng)法多采用樹突狀細(xì)胞為抗原呈遞細(xì)胞,利用巨細(xì)胞病毒抗原負(fù)載樹突狀細(xì)胞后,利用成熟的樹突狀細(xì)胞去刺激淋巴細(xì)胞獲得病毒特異性CTL[8]。四聚體篩選技術(shù),為利用HLA-多肽四聚體及磁珠分選的方法可從供者體內(nèi)分離針對CMV的特異CTL[9]。但四聚體篩選方法需提前明確患者的HLA的表達(dá),并篩選不同HLA位點識別的肽段。利用γ-干擾素直接從供者外周血分離CTL的方法為采集CMV血清學(xué)陽性供者外周血分離單個核細(xì)胞,將單個核細(xì)胞與pp65抗原孵育,標(biāo)記抗干擾素抗體,通過免疫磁珠分選陽性細(xì)胞,獲得cmv特異性ctl[10]。利用ifn-γ篩選雖然無hla限制性,但需要大量供者外周血,且實驗成本較高。以上方法均應(yīng)用供者外周血,有研究表明g-csf動員后的外周血單個核細(xì)胞可抑制t淋巴細(xì)胞增值,并降低其ifn-γ及il-4的釋放[11]。但隨后有中心驗證可以利用g-csf動員后的外周血制備cmv特異性ctl,且與傳統(tǒng)非動員pbmc進(jìn)行比較,生物學(xué)特性無明顯差異[12]。通過回顧性分析在本中心自2011年12月至2014年12月行異基因造血干細(xì)胞移植患者398例,應(yīng)用kaplanmeier及l(fā)ogistics回歸模型,分析了cmv感染的發(fā)生率及其發(fā)生的危險因素。經(jīng)分析得出,398例患者中233例發(fā)生cmv感染,累計發(fā)生率為58.5%。單因素分析中,hla不全相合、預(yù)處理過程中使用抗人免疫球蛋白(anti-humanthymocyteglobulig,atg)、發(fā)生急性移植物抗宿主病(acutegraftversushostdisease,agvhd)及激素用量≥1mg/kg潑尼松與cmv感染發(fā)生率增加有關(guān)。多因素分析中,hla不全相合(hr=2.765,p=0.000)、預(yù)處理過程中使用atg(hr=3.866,p=0.000)及激素用量≥1mg/kg潑尼松(hr=4.767,p=0.000)使cmv感染的風(fēng)險增加。綜上所述,供者與患者h(yuǎn)la不全相合、預(yù)處理過程中應(yīng)用atg及治療過程中激素用量≥1mg/kg潑尼松都會增加患者cmv感染的發(fā)生率。利用g-csf動員的外周血單個核細(xì)胞,通過貼壁法分離樹突狀細(xì)胞及淋巴細(xì)胞,并利用覆蓋中國人群90%以上巨細(xì)胞病毒多肽去負(fù)載樹突狀細(xì)胞并激活淋巴細(xì)胞,制備cmv-ctl。通過分析細(xì)胞表型、細(xì)胞內(nèi)ifn-γ檢測及細(xì)胞因子分泌的檢測來鑒定制備細(xì)胞的生物學(xué)特性。經(jīng)分析得出,經(jīng)培養(yǎng)淋巴細(xì)胞數(shù)量增多,cd3細(xì)胞比例明顯增高,經(jīng)抗原刺激后制備細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)ifn-γ分泌增高;細(xì)胞因子測定為ifn-γ、tnf-α及顆粒酶分泌相比陰性對照組明顯增高。綜上所述,經(jīng)該體系制備的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞具有特異性細(xì)胞殺傷活性。自2015年4月至2016年3月,共6例患者在本中心入組臨床試驗,應(yīng)用cmv特異性ctl治療造血干細(xì)胞移植后cmv感染。利用上述方法制備的cmv特異性ctl治療移植后cmv感染,輸注細(xì)胞數(shù)為1×107/m2/次,輸注周期為每周一次,直至cmv轉(zhuǎn)陰或連續(xù)輸注四次仍無效則停止輸注。cmv的監(jiān)測采用q-pcr法,每周兩次。經(jīng)分析得出,患者通過輸注cmv特異性ctl無不良反應(yīng)發(fā)生,可以有效控制患者cmv感染。本課題研究結(jié)果證明,行異基因造血干細(xì)胞移植患者中,供者與患者h(yuǎn)la不全相合、預(yù)處理過程中應(yīng)用atg及治療過程中激素用量≥1mg/kg潑尼松都會增加患者cmv感染的發(fā)生率;成功應(yīng)用g-csf動員后的外周血單個核細(xì)胞制備cmv特異性ctl,通過生物學(xué)檢測驗證其特異性殺傷活性;并應(yīng)用上述制備細(xì)胞進(jìn)行臨床試驗,試驗結(jié)果顯示cmv特異性ctl輸注可以有效控制cmv感染,且無明顯不良反應(yīng)發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R511;R457.7

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1 鄒秉含;利用G-CSF動員的PBMC制備的CMV-CTL治療異基因造血干細(xì)胞移植后HCMV感染的臨床研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2016年

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本文編號：1285961