本文關(guān)鍵詞：以主要流行EV71 VP1基因高度保守區(qū)為靶點(diǎn)的TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

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【摘要】：在我國(guó),腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)C4型是引起手足口病的主要流行基因型。為建立EV71C4型TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法,在C4型EV71VP1基因的高保守區(qū),設(shè)計(jì)合成引物和TaqMan探針,將包含此目的區(qū)段的基因片段克隆到pcDNA3.1載體中,通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得標(biāo)準(zhǔn)品,并以梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板建立工作曲線,進(jìn)而在優(yōu)化反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上建立TaqMan熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)中,所設(shè)計(jì)引物、探針的高度保守性保證了C4型EV71的高效擴(kuò)增。經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化,引物和探針的最佳工作濃度分別為300 nmol/L和200 nmol/L,在1×10~301×10~3拷貝數(shù)檢測(cè)范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R~2=1),靈敏度可達(dá)到10~2 copies/μL。通過(guò)對(duì)該方法進(jìn)行檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),批間和組間重復(fù)實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)均小于0.5%,且該方法對(duì)柯薩奇A16(coxsackievirus A16,CA16)柯薩奇B1(coxsackievirus B1,CB1)人輪狀病毒(human rotavirus,HRV)單純皰疹病毒2型(herpes Simplex virus type 2,HSV-2)均無(wú)交叉反應(yīng),對(duì)6份EV71陽(yáng)性樣本檢出率為100%。以上數(shù)據(jù)表明,文中建立的TaqMan熒光定量PCR方法可為我國(guó)主要流行C4型EV71感染的快速診斷及疾病監(jiān)控提供有效途徑。
【作者單位】： 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院云南省分子醫(yī)學(xué)研究中心;
【基金】：國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2014BAI01B01)
【分類號(hào)】：R512.5;R440
【正文快照】： 表1序列分析中所用的參考株信息Table 1 Background of the reference strains insequence analysisNumber12345678910111213Gen Bank No.HQ426649EU697902FJ158600FJ765423FJ765429HQ891925HQ456310HQ668280HM212465JF918554JN256065JN835284JN579745Number14151617181920212

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1 李曉婉;陳琦;金t，

本文編號(hào)：1270003