本文關鍵詞：以主要流行EV71 VP1基因高度保守區(qū)為靶點的TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立

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【摘要】：在我國,腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)C4型是引起手足口病的主要流行基因型。為建立EV71C4型TaqMan熒光定量PCR檢測方法,在C4型EV71VP1基因的高保守區(qū),設計合成引物和TaqMan探針,將包含此目的區(qū)段的基因片段克隆到pcDNA3.1載體中,通過體外轉錄獲得標準品,并以梯度稀釋的標準品為模板建立工作曲線,進而在優(yōu)化反應條件的基礎上建立TaqMan熒光實時定量PCR檢測方法。實驗中,所設計引物、探針的高度保守性保證了C4型EV71的高效擴增。經反應條件優(yōu)化,引物和探針的最佳工作濃度分別為300 nmol/L和200 nmol/L,在1×10~301×10~3拷貝數檢測范圍內具有良好的線性關系(R~2=1),靈敏度可達到10~2 copies/μL。通過對該方法進行檢驗發(fā)現(xiàn),批間和組間重復實驗的變異系數均小于0.5%,且該方法對柯薩奇A16(coxsackievirus A16,CA16)柯薩奇B1(coxsackievirus B1,CB1)人輪狀病毒(human rotavirus,HRV)單純皰疹病毒2型(herpes Simplex virus type 2,HSV-2)均無交叉反應,對6份EV71陽性樣本檢出率為100%。以上數據表明,文中建立的TaqMan熒光定量PCR方法可為我國主要流行C4型EV71感染的快速診斷及疾病監(jiān)控提供有效途徑。
【作者單位】： 昆明理工大學生命科學與技術學院云南省分子醫(yī)學研究中心;
【基金】：國家科技支撐計劃(2014BAI01B01)
【分類號】：R512.5;R440
【正文快照】： 表1序列分析中所用的參考株信息Table 1 Background of the reference strains insequence analysisNumber12345678910111213Gen Bank No.HQ426649EU697902FJ158600FJ765423FJ765429HQ891925HQ456310HQ668280HM212465JF918554JN256065JN835284JN579745Number14151617181920212

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本文編號：1270003