本文關(guān)鍵詞：登革病毒感染誘導(dǎo)A549細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生G3BP1顆粒

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【摘要】：登革病毒(Dengue virus,DENV)屬于黃病毒科黃病毒屬,按其免疫學(xué)特性可分為4個(gè)血清型。登革病毒通過蚊蟲叮咬進(jìn)入人體之后,根據(jù)臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度可分為登革熱(dengue fever,DF)、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever,DHF)、登革休克綜合征(dengue shock syndrome,DSS)。近幾十年登革熱發(fā)病率大幅度上升,WHO最新統(tǒng)計(jì)資料顯示每年約有1億人感染登革病毒,約50萬感染者會(huì)發(fā)展成登革出血熱,繼而發(fā)展成登革休克綜合征。登革病毒傳播所造成的危害已成為一個(gè)主要國際公共衛(wèi)生關(guān)切問題。雖然登革熱的流行日趨劇烈,但迄今為止,臨床上尚無特異性的抗登革病毒治療的藥物。宿主細(xì)胞在病毒感染后,可產(chǎn)生多種不同的應(yīng)答反應(yīng),包括自噬、凋亡、固有免疫應(yīng)答、應(yīng)激顆粒(stress granule,SG)形成等。SG是病毒感染真核細(xì)胞后誘導(dǎo)細(xì)胞eIF2a磷酸化,翻譯的起始受到阻滯,mRNA隨后與起始因子、核糖體亞基、mRNA結(jié)合蛋白(TIA-1、G3BP、Hu R等)結(jié)合,聚集形成的細(xì)胞質(zhì)RNA應(yīng)激顆粒。作為宿主應(yīng)對外界壓力的產(chǎn)物,其形成在抗病毒感染中起著重要作用。目前關(guān)于SG的組分、形成以及分解的研究日趨成熟,SG與病毒之間相互作用的報(bào)道也越來越多。在應(yīng)對不同病毒感染的時(shí)候,細(xì)胞形成SG的情況各異,大致可以分為以下三種:部分病毒對宿主產(chǎn)生的SG形成耐受,甚至利用SG的組分為其復(fù)制增殖服務(wù),保證其持續(xù)感染宿主細(xì)胞;部分病毒感染后誘導(dǎo)胞內(nèi)SG形成,直至感染中期,病毒利用自身產(chǎn)物與SG的成分相互作用,或者其他機(jī)制,局部或徹底抑制sg的形成;還有一些病毒感染細(xì)胞后,迅速阻遏胞內(nèi)sg形成,宿主細(xì)胞不能檢測到sg產(chǎn)生。已有文獻(xiàn)報(bào)道登革病毒感染bhk-21細(xì)胞后,可抑制sg的形成。但登革病毒感染人源細(xì)胞后是否可以誘導(dǎo)sg形成,目前仍然不明確。為此,本研究利用兩個(gè)登革病毒研究的常用人源細(xì)胞模型:肺癌上皮細(xì)胞系a549和人原代巨噬細(xì)胞,檢測登革病毒感染后應(yīng)激顆粒的產(chǎn)生情況;并初步探討了應(yīng)激顆粒形成與登革病毒復(fù)制的關(guān)系。第一部分,登革病毒誘導(dǎo)a549細(xì)胞形成g3bp1顆粒1.1目的檢測登革病毒感染a549細(xì)胞中,應(yīng)激顆粒組分蛋白g3bp1、tia-1的細(xì)胞定位;探究細(xì)胞顆粒的形成與病毒的復(fù)制水平的關(guān)系。1.2方法(1)通過免疫熒光檢測法檢測登革病毒感染a549細(xì)胞后,g3bp1、tia-1以及病毒蛋白prm的細(xì)胞定位情況。(2)在細(xì)胞感染denv2后,用poly(i:c)或者h(yuǎn)ipp處理誘導(dǎo)sg產(chǎn)生,通過免疫熒光檢測法檢測tia-1陽性細(xì)胞的比例,以及用tcid50法檢測感染上清中病毒的滴度。(3)通過sirna技術(shù)沉默sg組分g3bp1,然后通過免疫熒光檢測法比較g3bp1、tia-1以及病毒蛋白prm的變化;tcid50法檢測感染上清中病毒的滴度。(4)通過westernblot檢測denv感染的細(xì)胞中應(yīng)激顆粒形成的關(guān)鍵起始蛋白pkr和eif2α磷酸化情況。(5)通過免疫熒光檢測法檢測denv感染的細(xì)胞中dsrna的變化。1.3結(jié)果(1)登革病毒感染的a549細(xì)胞中,g3bp1被招募進(jìn)細(xì)胞質(zhì)顆粒中。(2)sg的形成與登革病毒復(fù)制水平呈負(fù)相關(guān)。(3)sg對病毒復(fù)制具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。(4)pkr和eif2α的磷酸化主要發(fā)生在病毒感染的后期。(5)dsrna的積累在病毒感染的中后期被檢測到。1.4結(jié)論在登革病毒感染的a549細(xì)胞中,g3bp1不依賴tia-1形成顆粒;應(yīng)激顆�？梢砸种频歉锊《镜膹�(fù)制;登革病毒dsrna的產(chǎn)生和pkr的活化發(fā)生于病毒感染的晚期,提示病毒可能通過延遲dsrna的產(chǎn)生和pkr的活化抑制sg的形成。第二部分,登革病毒感染單核巨噬細(xì)胞形成g3bp1顆粒2.1目的誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化;檢測登革病毒感染巨噬細(xì)胞后g3bp1、tia-r的細(xì)胞定位,初步分析巨噬細(xì)胞的應(yīng)激顆粒的形成與病毒復(fù)制之間的相互關(guān)系。2.2方法(1)通過免疫磁珠分選人外周血cd14+單核細(xì)胞并檢測分選后純度。(2)顯微鏡觀察cd14+單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的形態(tài)變化。(3)通過免疫熒光檢測法檢測登革病毒感染巨噬細(xì)胞后,sg組分g3bp1、tiar以及病毒蛋白ns1的細(xì)胞定位。2.3結(jié)果(1)采用免疫磁珠陽性分選可以獲得高純度(85%)的cd14+細(xì)胞。(2)cd14+單核細(xì)胞誘導(dǎo)后貼壁牢固,體積明顯增大,形狀逐漸變成煎蛋狀或長梭形。(3)在登革病毒感染的巨噬細(xì)胞里,G3BP1被招募進(jìn)細(xì)胞質(zhì)顆粒中,但TIAR不會(huì)形成顆粒。2.4結(jié)論登革病毒感染的巨噬細(xì)胞里,G3BP1可以不依賴TIAR誘導(dǎo)聚集成顆粒;與登革病毒感染A549細(xì)胞的結(jié)果一致。
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.8
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本文編號：1269739