本文關(guān)鍵詞：TLR-2介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路在光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細(xì)胞中的作用研究

  更多相關(guān)文章： 光滑念珠菌 大鼠氣道上皮細(xì)胞 TLR-2受體 NF-κB(p65) TNF-α IL-6

【摘要】：第一部分光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細(xì)胞的研究目的:通過建立光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細(xì)胞(Rat tracheal epithelia cell,RTEC)的體外模型,觀察光滑念珠菌感染RTEC在不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖、周期及凋亡的變化,分別在蛋白和細(xì)胞水平檢測TLR-2、NF-κB(p65)、TNF-α和IL-6表達(dá)情況,以探討TLR-2受體介導(dǎo)的NF-κB(p65)信號(hào)通路在光滑念珠菌感染RTEC的研究。方法:RTEC感染光滑念珠菌,感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)為1。在0h、2h、4h及6h終止感染,分別采用CCK-8(cell counting kit 8,CCK-8)檢測細(xì)胞存活率。流式細(xì)胞儀檢測在不同感染時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞周期和凋亡變化情況。Western Blot(WB)方法檢測細(xì)胞膜表面TLR-2受體及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(p65)在不同感染時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。ELISA方法檢測下游細(xì)胞因子TNF-α和IL-6在不同感染時(shí)間點(diǎn)的分泌情況。結(jié)果:CCK-8法檢測結(jié)果表明,隨著時(shí)間的延長,光滑念珠菌感染對(duì)RTEC的增殖有明顯的抑制作用。流式細(xì)胞儀檢測周期結(jié)果顯示,光滑念珠菌感染細(xì)胞能夠使細(xì)胞的生長周期阻滯在G0/G1期,抑制細(xì)胞的增殖,從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。采用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,隨著感染時(shí)間的延長,細(xì)胞凋亡的比例顯著增加。Western Blot結(jié)果表明,隨著感染時(shí)間的延長TLR-2受體與NF-κB(p65)蛋白表達(dá)水平顯著增加。ELISA結(jié)果表明,TNF-α和IL-6分泌水平也隨著感染時(shí)間的延長而顯著升高。結(jié)論:光滑念珠菌感染RTEC能抑制細(xì)胞增殖,降低細(xì)胞存活率。在靜息狀態(tài)下TLR-2受體表達(dá)水平較低,在光滑念珠菌感染的過程中能啟動(dòng)tlr-2受體的表達(dá),并激活核轉(zhuǎn)錄因子nf-κb(p65),誘導(dǎo)下游細(xì)胞因子和炎癥因子tnf-α和il-6的分泌及表達(dá)。這一現(xiàn)象可能在rtec應(yīng)對(duì)光滑念珠菌感染的免疫防御調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要的作用。第二部分sirna干擾tlr-2受體對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞的影響目的:sirna干擾tlr-2受體對(duì)光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細(xì)胞(rtec)的影響。方法:通過轉(zhuǎn)染sirna抑制rtectlr-2受體(toll-likereceptor2,tlr-2)的表達(dá),構(gòu)建感染模型,采用與第一部分相同的檢測方法,進(jìn)一步觀察轉(zhuǎn)染后感染光滑念珠菌的rtec增殖、周期和凋亡變化情況,以及tlr-2受體、核轉(zhuǎn)錄因子nf-κb(p65)、下游細(xì)胞因子tnf-α和il-6的表達(dá)變化。結(jié)果:轉(zhuǎn)染tlr-2sirna的rtec感染光滑念珠菌后進(jìn)一步抑制細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞儀檢測周期結(jié)果表明,細(xì)胞在g0/g1生長期的比例增高,細(xì)胞生長周期阻滯在g0/g1期,進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。采用annexinv-fitc/pi雙染色流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示,隨著感染時(shí)間的延長,細(xì)胞凋亡的比例顯著增加。westernblot及elisa結(jié)果均表明,轉(zhuǎn)染后tlr-2、nf-κb(p65)、tnf-α和il-6的表達(dá)水平顯著降低。結(jié)論:tlr-2受體可以啟動(dòng)光滑念珠菌感染rtec的免疫反應(yīng),并引起炎癥反應(yīng),表明是由于tlr-2受體介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。rtec啟動(dòng)tlr-2受體的表達(dá)是建立在tlr-2受體對(duì)光滑念珠菌早期識(shí)別的基礎(chǔ)上,并通過tlr-2--nf-κb下游信號(hào)通路啟動(dòng)tlr-2受體的表達(dá)。第三部分NF-KB抑制劑PDTC抑制NF-KB的活性對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞的影響目的:探討NF-KB抑制劑(PDTC)對(duì)光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細(xì)胞(RTEC)的影響。方法:加入PDTC預(yù)處理RTEC 2h后,建立體外感染模型,采用與第一及第二部分相同的檢測方法,進(jìn)一步觀察加入PDTC后,感染光滑念珠菌的RTEC增殖、周期和凋亡的變化情況,以及TLR-2受體、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(p65)、下游細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)變化。結(jié)果:加入PDTC預(yù)處理的RTEC與轉(zhuǎn)染si RNA抑制RTEC TLR-2受體的結(jié)果類似,感染光滑念珠菌后均抑制細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞儀檢測周期結(jié)果表明,細(xì)胞在G0/G1生長期的比例增高,細(xì)胞生長周期阻滯在G0/G1期,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。采用Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示,隨著感染時(shí)間的延長,細(xì)胞凋亡的比例顯著增加。預(yù)處理后的TLR-2受體、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(p65)在前4h表達(dá)受到抑制,雖然NF-κB(p65)在第6h有所升高但也只是達(dá)到基線水平,TNF-α和IL-6的分泌水平顯著降低。結(jié)論:TLR-2受體是通過激活NF-κB(p65)信號(hào)通路介導(dǎo)光滑念珠菌感染大鼠氣道上皮細(xì)胞(RTECs)啟動(dòng)天然免疫。
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R519.3

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;The roles of surfactant protein D during Aspergillus fumigatus infection in human corneal epithelial cells[J];International Journal of Ophthalmology(English Edition);2012年01期

，

本文編號(hào)：1222866