發(fā)布時(shí)間：2017-11-23 17:18

  本文關(guān)鍵詞：多重微球芯片技術(shù)應(yīng)用于病毒性疾病診斷的研究

  更多相關(guān)文章： 多重微球芯片技術(shù) 病毒性疾病 病毒性出血熱 腸道病毒71型 VP1

【摘要】：美國(guó)Luminex公司近年來開發(fā)了一種高通量檢測(cè)技術(shù)——多重微球芯片技術(shù)(Multiple·Bead·Array·Assays),它是以熒光編碼的微球?yàn)檩d體,整合應(yīng)用流體學(xué)、激光分析、高速數(shù)字信號(hào)處理、計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則等多項(xiàng)技術(shù)的多重檢測(cè)分析平臺(tái),其最大的特點(diǎn)是可實(shí)現(xiàn)最多同時(shí)快速檢測(cè)100種指標(biāo),且檢測(cè)目標(biāo)物涵蓋了抗體、核酸、細(xì)胞因子等多種生物分子,被國(guó)際業(yè)界專家評(píng)價(jià)為臨床診斷的趨勢(shì)性技術(shù)之一。本研究的主要目的是將多重微球芯片技術(shù)應(yīng)用于病毒性疾病的診斷研究,以進(jìn)一步完善病毒性疾病實(shí)驗(yàn)室的診斷方法。研究的第一部分通過應(yīng)用該技術(shù)建立起快速、靈敏、高通量的病毒性出血熱疾病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,以期對(duì)我國(guó)常見病毒性出血熱臨床樣本進(jìn)行快速篩查和診斷。方法是將表達(dá)純化的十三種出血熱病毒的重組蛋白分別偶聯(lián)至熒光微球,通過對(duì)相應(yīng)多克隆兔血清的單重檢測(cè)來評(píng)價(jià)抗原偶聯(lián)效果,再用偶聯(lián)好的13重?zé)晒馕⑶蛳确謩e檢測(cè)96份正常人血清的Ig M和Ig G抗體來確定該多重血清學(xué)檢測(cè)方法的cutoff值,為評(píng)價(jià)該方法對(duì)我國(guó)常見病毒性出血熱疾病的檢測(cè)效果,分別檢測(cè)了已通過RT-PCR或ELISA方法確診為陽性血清的71份HFRS病人急性期血清和73份HFRS病人恢復(fù)期血清、各41份SFTS病人急性期和恢復(fù)期血清、50份DENGUE病人急性期血清和64份DENGUE病人恢復(fù)期血清。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示,本研究建立的針對(duì)我國(guó)常見三大病毒性出血熱的13重微球芯片檢測(cè)方法具有高靈敏度和特異度,不管是對(duì)急性期血清還是恢復(fù)期血清的檢測(cè),皆與金標(biāo)準(zhǔn)的符合率高,且Kappa值均大于或等于0.75,一致性程度很好。應(yīng)用多重微球芯片技術(shù)建立針對(duì)我國(guó)常見病毒性出血熱診斷方法的初步成功,使得快速、靈敏、高通量的病毒性出血熱疾病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法或成為可能。與此同時(shí),我們也正嘗試將這一技術(shù)應(yīng)用于另一類病毒性疾病——腸道病毒引起的手足口病的檢測(cè)工作。EV71是導(dǎo)致手足口病的重要病原體,在應(yīng)用多重微球芯片技術(shù)檢測(cè)血清的方法研究中,前期病毒蛋白抗原的表達(dá)、純化和鑒定至關(guān)重要,所以在本研究的后半部分,我們利用原核表達(dá)菌大腸桿菌BL21(DE3)對(duì)EV71-VP1蛋白進(jìn)行表達(dá)及純化,同時(shí)對(duì)重組表達(dá)蛋白的抗原活性進(jìn)行鑒定。EV71-VP1蛋白的表達(dá)是通過提取病毒RNA,擴(kuò)增含VP1全長(zhǎng)基因片段;經(jīng)TA克隆、測(cè)序證實(shí)序列無誤后,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增完整的病毒VP1基因并克隆至p ET32a(+)表達(dá)載體上,構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)菌大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物的含量和抗原活性采用SDS-PAGE、Western Blot等試驗(yàn)鑒定。本研究結(jié)果顯示構(gòu)建的p ET32a/LY008-VP1重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)后可表達(dá)VP1蛋白,重組蛋白的分子量符合預(yù)期,Western Blot證實(shí)具有強(qiáng)抗原活性。至此,在本次將多重微球芯片技術(shù)應(yīng)用于病毒性疾病的研究中,我們主要完成了將其應(yīng)用于我國(guó)病毒性出血熱診斷的研究部分,同時(shí)我們建立起本實(shí)驗(yàn)室的全套蛋白表達(dá)系統(tǒng),為接下來其他重要腸道病毒蛋白的表達(dá)提供了技術(shù)思路,也給建立基于多重微球芯片技術(shù)平臺(tái)的快速、靈敏、高通量的手足口病或其他病毒性疾病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法做好了前期準(zhǔn)備。此外,表達(dá)的VP1重組蛋白也可以進(jìn)一步研究用于EV71血清流行病學(xué)調(diào)查的開展以及為抗EV71單克隆抗體的研究、研發(fā)針對(duì)EV71感染的疫苗或構(gòu)建EV71感染的早期快速診斷試劑等奠定了重要基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R511;R440

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 楊國(guó)威,何雅清,薛穎,周世力,馬驪,金奇;腸道病毒71型外殼蛋白VP1在Pichia pastoris酵母中的表達(dá)[J];病毒學(xué)報(bào);2003年02期

2 周世力,楊帆,金奇;腸道病毒71型的研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2003年03期

3 李晶華;方小楠;;腸道病毒71型研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2011年03期

4 張壽斌;廖華;黃呈輝;譚慶瑜;張煒靈;黃艷;陳侃;邱素清;林靜;幸思忠;廖月紅;;深圳237例手足口病腸道病毒血清型基因及臨床特征[J];中國(guó)當(dāng)代兒科雜志;2008年01期

5 范麗;李裕昌;康曉平;林方;魏婧靖;楊銀輝;熊正英;;Luminex液相芯片技術(shù)檢測(cè)6種蟲媒病毒方法的建立[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2012年05期

6 周曉芳;盛海剛;;Luminex系統(tǒng)的技術(shù)原理與應(yīng)用[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2010年04期

7 俞錢;徐紅星;朱琴芳;;流式熒光雜交法檢測(cè)人乳頭瘤病毒基因型的臨床應(yīng)用[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2010年04期

8 唐啟慧;田新貴;林斌;向開軍;周榮;;腸道病毒71型衣殼蛋白VP1基因部分序列在大腸桿菌中的表達(dá)[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2008年01期

9 江麗鳳;葉鵬凌;高風(fēng)華;馮謙謹(jǐn);郭中敏;陸家海;;中國(guó)大陸EV71病毒分離株的分子流行病學(xué)研究[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2011年12期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 蕪為;基于Luminex平臺(tái)的病毒性出血熱多重血清學(xué)檢測(cè)方法的建立及其評(píng)價(jià)[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2014年

，

本文編號(hào)：1219230