本文關(guān)鍵詞：抗華支睪吸蟲親環(huán)素A抗體對(duì)急慢性炎癥損傷的保護(hù)作用

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【摘要】：研究背景:免疫系統(tǒng),是多細(xì)胞生物體,特別是哺乳動(dòng)物保護(hù)自身組織器官健康、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要防御系統(tǒng)。各種炎癥細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞因子、化學(xué)介質(zhì)及細(xì)胞接觸介導(dǎo)的信號(hào)交流,實(shí)現(xiàn)統(tǒng)一的調(diào)控與調(diào)配。正常的免疫系統(tǒng)經(jīng)由大量的正向和反向的調(diào)控過(guò)程維持其相對(duì)平衡狀態(tài),免疫功能不足和過(guò)度或免疫調(diào)節(jié)的失衡,都會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生。炎癥是機(jī)體在組織損傷和感染時(shí)所表現(xiàn)出來(lái)的一種免疫學(xué)過(guò)程,適度的暫時(shí)的炎癥反應(yīng)能幫助機(jī)體抵抗感染,促進(jìn)組織修復(fù);過(guò)度的和慢性的炎癥導(dǎo)致疾病的進(jìn)展惡化并誘發(fā)多種慢性病。過(guò)炎癥反應(yīng)性疾病(如感染所致的膿毒癥),局部的炎癥病變擴(kuò)展為系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS),繼而引發(fā)多器官功能衰竭(MODS),最終導(dǎo)致患者死亡。多種體內(nèi)和環(huán)境的理化因素、衰老、氧化應(yīng)激等可刺激機(jī)體產(chǎn)生輕中度的慢性炎癥引起細(xì)胞損傷與凋亡,甚至持續(xù)激活機(jī)體炎癥細(xì)胞,引起多個(gè)組織器官系統(tǒng)的代謝和功能異常,使機(jī)體呈現(xiàn)持續(xù)高消耗狀態(tài),造成營(yíng)養(yǎng)不良,引起多種慢性疾病,如高血壓、糖尿病、冠心病、肝纖維化、慢性腎炎、腫瘤、老年性癡呆等�？梢哉f(shuō),不可控炎癥和慢性炎癥反應(yīng)是幾乎所有重癥感染性疾病和慢性病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。有效地調(diào)控炎癥反應(yīng)過(guò)程使其恢復(fù)平衡狀態(tài)是防治疾病的關(guān)鍵。目前對(duì)炎癥反應(yīng)性疾病的干預(yù),幾乎都是針對(duì)病灶部位的特定的終末炎癥細(xì)胞和介質(zhì)進(jìn)行調(diào)控。由于不同器官系統(tǒng)病理生理過(guò)程的異質(zhì)性,臨床相應(yīng)采用的各種抗炎癥治療方案基本上都是末端調(diào)控,治標(biāo)不治本,往往是短時(shí)間內(nèi)緩解,反復(fù)發(fā)作。不同組織器官、不同類型的炎癥反應(yīng),有沒有共同的病理生理學(xué)分子機(jī)制?如果能找到上游的共同的炎癥反應(yīng)始動(dòng)因素,就能從源頭上干預(yù)炎癥反應(yīng)過(guò)程,有效預(yù)防和控制各類急慢性炎癥反應(yīng)性疾病,實(shí)現(xiàn)“治本”的目標(biāo)。我們通過(guò)對(duì)大量文獻(xiàn)的閱讀,試圖尋找出擔(dān)當(dāng)這一角色的分子。我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)不太引人關(guān)注的多功能蛋白親環(huán)素A(Cyclophilin A,CyPA)具有這樣的潛力。CyPA是一種在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用的蛋白,屬于一個(gè)保守的管家基因家族親免素的成員,廣泛存在于部分原核及所有真核生物細(xì)胞內(nèi),不同物種間的CyPA的氨基酸序列有高度的同源性。CyPA分子具有兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的功能域,分別承擔(dān)肽酰-脯氨酸順?lè)串悩?gòu)酶(PPIase)活性和核酸酶活性。通常情況下,CyPA主要存在于細(xì)胞內(nèi),是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的蛋白之一,約占胞質(zhì)中蛋白分子總數(shù)的1%,主要發(fā)揮分子伴侶的作用,通過(guò)其PPIase酶活性,參與細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的構(gòu)象改變和功能的調(diào)節(jié),以促進(jìn)新生肽鏈的正確折疊,也參與了一些病毒的感染和細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。CyPA同時(shí)具有非經(jīng)典途徑分泌信號(hào),當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下,細(xì)胞內(nèi)的CyPA經(jīng)由非經(jīng)典途徑釋放到細(xì)胞外。細(xì)胞外的CyPA通過(guò)其PPIase酶活性中心識(shí)別存在于內(nèi)皮細(xì)胞及炎癥細(xì)胞表面的CD147受體上的脯氨酸殘基,改變受體分子的構(gòu)象,激活相應(yīng)的信號(hào)通路,可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,提高血管通透性,利于局部炎癥細(xì)胞滲出浸潤(rùn)。因此CyPA是一種重要的炎癥細(xì)胞和一些淋巴細(xì)胞的趨化因子,募集這些免疫細(xì)胞到達(dá)損傷部位,促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)。細(xì)胞的損傷和破壞,也使得細(xì)胞內(nèi)大量的CyPA釋放出來(lái),參與炎癥反應(yīng)過(guò)程。由于CyPA分布廣泛,其在炎癥中的作用主要涉及早期的誘導(dǎo)與炎癥的引發(fā)。大量研究文獻(xiàn)證實(shí):腫瘤、病毒感染、糖尿病、膿毒癥、自身免疫系統(tǒng)疾病等都伴有CyPA的高表達(dá)和分泌。寄生蟲是單細(xì)胞或多細(xì)胞的真核生物,與宿主構(gòu)成一種特殊的共生關(guān)系。寄生蟲一方面通過(guò)蟲體移行對(duì)宿主造成機(jī)械損傷,或通過(guò)其分泌的蛋白或代謝排泄產(chǎn)物的化學(xué)損傷,引起宿主的炎癥反應(yīng),即寄生蟲病;另一方面,寄生蟲也能對(duì)宿主的免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié),降低宿主對(duì)蟲體的免疫攻擊力,產(chǎn)生免疫逃避得以生存和發(fā)育,完成其生活史過(guò)程。寄生蟲感染對(duì)宿主的免疫調(diào)節(jié)作用,勢(shì)必會(huì)影響機(jī)體對(duì)其他刺激的炎癥反應(yīng)過(guò)程。在發(fā)達(dá)國(guó)家,由于其經(jīng)濟(jì)水平、生活水平及環(huán)境水平的提高,人群寄生蟲感染率已降到很低的水平。然而,大數(shù)據(jù)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),隨著寄生蟲病的日益減少,人群免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病、重癥感染等疾病的發(fā)病率不斷上升,人群總體健康水平并沒有因此得到提高。因此,經(jīng)典的寄生蟲與宿主的關(guān)系的概念面臨著新的挑戰(zhàn)。我們從人體生態(tài)系統(tǒng)的視角和自然辨證法的高度,提出了對(duì)寄生關(guān)系新的理解,即是寄生蟲和宿主之間是一種互有利害的妥協(xié)的共生關(guān)系。寄生蟲在給宿主造成一定程度的損傷的同時(shí),也賦予了宿主更強(qiáng)大的的免疫平衡和調(diào)節(jié)能力。寄生蟲與宿主在長(zhǎng)期共同進(jìn)化過(guò)程中,某些彼此密切作用的蛋白分子出現(xiàn)了趨同進(jìn)化的現(xiàn)象,在結(jié)構(gòu)和功能方面變得更加相似,以降低寄生蟲蛋白的免疫原性,提高免疫相容性,實(shí)現(xiàn)免疫逃避的目的。此外,一些參與疾病過(guò)程的寄生蟲和宿主直系同源蛋白之間的高相似性也賦予了它們之間的免疫交叉反應(yīng)性,宿主針對(duì)寄生蟲蛋白的抗體會(huì)通過(guò)免疫交叉反應(yīng)中和或抑制內(nèi)源性同源蛋白的致病作用。正是基于這種認(rèn)識(shí),本實(shí)驗(yàn)室在之前研究中,從華支睪吸蟲分泌排泄抗原中鑒定出與宿主CyPA高度同源的華支睪吸蟲親還素A(Clonorchis sinensis Cyclophilin A,Cs CyPA)。研究證實(shí)Cs CyPA免疫宿主可以產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,并且和宿主的CyPA有免疫交叉反應(yīng)性。宿主的CyPA與這種抗體結(jié)合后,對(duì)宿主CyPA所介導(dǎo)的急性及慢性炎癥反應(yīng)是否能產(chǎn)生保護(hù)作用是本論文要研究和闡述的主要問(wèn)題。研究目的:通過(guò)建立膿毒癥模型及胰島β細(xì)胞損傷模型,闡述CyPA在急慢性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮的作用,并觀察抗Cs CyPA抗體可否對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用,從而理解寄生蟲藥物對(duì)人體疾病預(yù)防和治療的重要性。研究方法:1.CyPA生物信息學(xué)分析及同源性比較自Genebank中下載4個(gè)物種CyPA的序列,對(duì)比其相似度。用Motif Scan軟件預(yù)測(cè)其PPIase酶活性位點(diǎn)。采用BLAST進(jìn)行序列及酶活性區(qū)域比對(duì)。2.不同物種重組CyPA(r CyPA)與抗r Cs CyPA抗體的免疫反應(yīng)性檢測(cè)使用蛋白免疫印跡技術(shù)(Western Blot)檢測(cè)抗r Cs CyPA抗體與r Cs CyPA,r Sj CyPA,r Mu CyPA和r Hs CyPA之間的免疫反應(yīng)性。3.酶活性檢測(cè)PPIase酶活性檢測(cè)依照Fischer總結(jié)的chymotrypsin-coupledcleavage檢測(cè)法進(jìn)行。4.抗r Cs CyPA抗體對(duì)急性炎癥反應(yīng)----膿毒癥的治療作用研究4.1抗r Cs CyPA抗體制備收集r Cs CyPA蛋白免疫后SD大鼠血清,采用硫酸銨沉淀結(jié)合G-Sepharose柱法進(jìn)行抗體純化。并用BCA檢測(cè)抗體蛋白濃度。4.2膿毒癥小鼠模型建立采用小鼠盲腸結(jié)扎穿刺模型建立72h死亡率高達(dá)80%的急性膿毒癥模型。4.3細(xì)胞因子及CyPA檢測(cè)CLP手術(shù)后,6、12、24、48、72小時(shí)分別取小鼠血清使用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-4,IL-10,CyPA濃度。4.4小鼠肺及腸系膜組織病理變化CLP手術(shù)后,6、12、24、48、72小時(shí)分別取小鼠腸系膜及肺組織,進(jìn)行石蠟包埋切片及HE染色,而后觀察病理變化。4.5凝血樣本收集及指標(biāo)檢測(cè)小鼠血液通過(guò)抗凝管收集,所有實(shí)驗(yàn)必須在取樣后4h內(nèi)完成。凝血酶時(shí)間(PT),活化部分凝血活酶時(shí)間(a PTT)使用automated coagulometer進(jìn)行檢測(cè);血小球計(jì)數(shù)使用自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行檢測(cè),血漿D-二聚體通過(guò)D2D ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。4.6血管內(nèi)皮細(xì)胞分離,培養(yǎng),處理小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)按照Mika Kobayashi 2005年提出的設(shè)計(jì)方法并有所改進(jìn)。提取小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,并與r Mu CyPA及抗r Cs CyPA抗體共孵育。細(xì)胞活力通過(guò)CCK-8來(lái)檢測(cè)。5.抗r Cs CyPA抗體對(duì)慢性炎癥反應(yīng)----STZ誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷的預(yù)防作用研究5.1小鼠免疫r Cs CyPA蛋白免疫C57小鼠。初次免疫,50μg蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合后于小鼠腹部皮下多點(diǎn)免疫。間隔10天后,25μg蛋白和等體積的弗氏不完全佐劑混合,腹部皮下多點(diǎn)加強(qiáng)免疫,共2次。每次免疫前及末次免疫1周后小鼠尾部采血。5.2 STZ高脂飲食構(gòu)建胰島β細(xì)胞損傷模型依照J(rèn)ames Mu等所建立的藥物誘導(dǎo)合并高脂飲食導(dǎo)致小鼠胰島損傷模型。給與4周高脂飲食,一次性腹腔注射鏈脲霉素(streptozocin,STZ),再給予6周高脂飲食并持續(xù)觀察。5.3體重及血糖指標(biāo)變化持續(xù)測(cè)量體重,并用羅氏血糖儀持續(xù)監(jiān)測(cè)血糖5.4口服糖耐量小鼠第10周,灌胃葡萄糖溶液(2g/kg),記錄灌胃后0、30、60、90、120分鐘血糖變化。5.5胰島免疫熒光變化及細(xì)胞計(jì)數(shù)新鮮獲取的胰腺組織浸泡于10%多聚甲醛中至少48h。石蠟包埋切片,采用抗胰島素抗體和抗胰高血糖素抗體進(jìn)行免疫熒光雙染,被標(biāo)記為紅色熒光區(qū)域?yàn)橐葝uα細(xì)胞,被標(biāo)記為綠色熒光的區(qū)域?yàn)橐葝uβ細(xì)胞。Image-Pro Plus6.0進(jìn)行胰島細(xì)胞計(jì)數(shù)。5.6血清CyPA,胰島素,炎癥因子水平采用相應(yīng)的ELISA試劑盒進(jìn)行血清濃度檢測(cè)。研究結(jié)果:1.生物信息學(xué)分析Cs CyPA與日本血吸蟲、小鼠、人的CyPA的相似度分別為66%,74%和74%。Cs CyPA的PPIase酶活性區(qū)域與日本血吸蟲、小鼠、人的CyPA酶活性區(qū)域的相似度分別為92%,83%和83%。2.免疫反應(yīng)性r Cs CyPA,r Sj CyPA,r Mu CyPA和r Hs CyPA均可以與抗r Cs CyPA抗體結(jié)合,與PBS沒有反應(yīng)。結(jié)果說(shuō)明華支睪吸蟲、日本血吸蟲、小鼠、人的CyPA蛋白與抗r Cs CyPA抗體具有相似的免疫反應(yīng)性。3.酶活性及抑制r Mu CyPA蛋白具有PPIase酶活性,并且酶活性成劑量依賴性。加了抗體的反應(yīng)體系酶促反應(yīng)速率明顯下降,并與所加入抗體的量成計(jì)量相關(guān)性。4.抗r Cs CyPA抗體對(duì)膿毒癥小鼠治療效果評(píng)價(jià)4.1生存率生存率檢測(cè)在手術(shù)后72h進(jìn)行。假手術(shù)組全部存活,生存率為100%。在CLP控制組,生存率為10%。在CLP治療組,其生存率為45%。CLP控制組與CLP治療組之間存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。4.2血清CyPA含量變化CLP術(shù)后,小鼠血清CyPA含量明顯增加。在6、12、24、48小時(shí),CLP控制組與假手術(shù)組CyPA含量存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),在72h時(shí)兩組的數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4.3炎癥因子變化4.3.1促炎因子——TNF-α,IL-6,IL-1βCLP控制組小鼠手術(shù)后,血清中三種炎癥因子水平都有升高。TNF-α水平術(shù)后增加,并于術(shù)后24h達(dá)到最大值。IL-6水平術(shù)后增加,并于術(shù)后12h達(dá)到最大值。IL-1β水平術(shù)后增加,并于術(shù)后12h達(dá)到最大值。與CLP控制組相比,CLP實(shí)驗(yàn)組在注射抗體后,小鼠血清中TNF-α,IL-6,IL-1β的水平在術(shù)后12h及24h明顯降低(P0.05)。其他時(shí)間段與控制組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.3.2抑炎因子——IL-4,IL-10CLP控制組小鼠手術(shù)后,血清中2種炎癥因子水平都有升高。IL-4水平術(shù)后增加,并于術(shù)后24h達(dá)到最大值。IL-10水平術(shù)后增加,并于術(shù)后24h達(dá)到最大值。與CLP控制組相比,CLP實(shí)驗(yàn)組在注射抗體后,小鼠血漿中IL-4,IL-10的水平在術(shù)后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.4肺組織及腸系膜病理變化4.4.1肺組織病理變化CLP控制組,手術(shù)后12h肺組織出現(xiàn)明顯的較大的血栓,術(shù)后48h及72h出現(xiàn)明顯的出血、白細(xì)胞滲出、炎癥細(xì)胞聚集、肺泡壁增厚、肺泡間隙閉塞。CLP治療組在術(shù)后24h出現(xiàn)了較明顯的血栓。在48h及72h可見較為明顯的白細(xì)胞滲出及水腫,但是無(wú)明顯的出血及肺泡間隙閉塞。4.4.2腸系膜組織病理變化CLP控制組,大量的白細(xì)胞在術(shù)后6h滲出血管。術(shù)后72h可以明顯觀察到細(xì)胞溶解,梭形細(xì)胞和彌漫性腸系膜纖維化。在CLP治療組中,炎性病灶受限,有些部位的脂肪細(xì)胞在病變后72h仍然保持正常形態(tài)。4.5凝血指標(biāo)檢測(cè)小鼠CLP模型成功的誘導(dǎo)了DIC。CLP控制組與假手術(shù)組相比,血小板計(jì)數(shù),纖維蛋白原濃度,PT,a PTT,D-dimer在術(shù)后6小時(shí)都有明顯變化。在血小板計(jì)數(shù),PT,a PTT,D-dimer數(shù)據(jù)上,CLP治療組與CLP控制組相比都有明顯的改觀,特別是在術(shù)后48h及72h,治療組的DIC得到明顯改善。4.6血管內(nèi)皮細(xì)胞生存率檢測(cè)r Mu CyPA促使細(xì)胞數(shù)量減少,蛋白對(duì)細(xì)胞數(shù)量的作用呈劑量依賴性。與10μg r Mu CyPA組相比,加入1μg和10μg抗體組能明顯促進(jìn)細(xì)胞生存,10μg抗體組作用最強(qiáng),0.1μg抗體組沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。5.r Cs CyPA免疫對(duì)STZ誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷的保護(hù)作用5.1體重變化注射藥物STZ后,PBS免疫組及r Cs CyPA免疫組開始出現(xiàn)體重的下降,并逐漸低于正常組小鼠。與PBS免疫組相比,r Cs CyPA免疫組小鼠體重下降較為緩慢。正常組小鼠由于未使用STZ,其體重穩(wěn)步增長(zhǎng),并無(wú)下降趨勢(shì),并于實(shí)驗(yàn)第8-10周穩(wěn)定于27g左右。5.2血糖指標(biāo)變化正常組小鼠基本維持在9左右。STZ注射后,PBS免疫組及r Cs CyPA免疫組血糖明顯降低。與PBS免疫組小鼠相比,r Cs CyPA免疫組小鼠在注射前血糖升高較慢,注射后血糖下降較慢,趨勢(shì)不如PBS免疫組變化明顯。5.3口服糖耐量在給予葡萄糖之后,三組小鼠血糖水平明顯升高,升高幅度基本一致,繼而開始下降。正常組在試驗(yàn)后120分鐘血糖恢復(fù)正常。r Cs CyPA免疫組和PBS免疫組血糖下降均較慢。120分鐘時(shí),r Cs CyPA免疫組血糖與空腹相比尚升高14%,PBS免疫組血糖與空腹相比尚升高100%。因此r Cs CyPA免疫組胰島β細(xì)胞狀態(tài)較PBS免疫組狀態(tài)好,尚有部分功能保留。5.4胰島免疫熒光變化及細(xì)胞計(jì)數(shù)與正常組相比,PBS免疫組及r Cs CyPA免疫組在注射STZ后,胰島中心的β細(xì)胞區(qū)域出現(xiàn)裂隙及紅色熒光滲透,提示出現(xiàn)大量胰島β細(xì)胞的壞死或凋亡。r Cs CyPA免疫組2w與正常組之間β細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PBS免疫組與r Cs CyPA免疫組4w、6w均有明顯的區(qū)別,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5.5血清CyPA水平正常小鼠血清CyPA含量很低。注射STZ之后,PBS免疫組各個(gè)時(shí)間段與正常組相比,CyPA水平都明顯升高,并隨時(shí)間推進(jìn)逐漸增加。與之相比,r Cs CyPA免疫組CyPA含量與正常組小鼠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5.6血胰島素水平PBS免疫組2w、4w、6w及r Cs CyPA免疫組4w、6w與正常組相比,胰島素分泌減少,其結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。提示在上述時(shí)間段,兩組小鼠胰島β細(xì)胞均有較明顯損傷。各個(gè)時(shí)間段相對(duì)比,r Cs CyPA免疫組與PBS免疫組均有明顯的差異(P0.05),r Cs CyPA免疫組血胰島素水平較PBS免疫組高。提示r Cs CyPA免疫組小鼠胰島β細(xì)胞功能有一定保留抗r Cs CyPA抗體對(duì)小鼠胰島β細(xì)胞有一定的保護(hù)。5.7血炎癥因子IL-1β與TNF-α在r Cs CyPA免疫組與PBS免疫組基本相似,說(shuō)明小鼠在注射STZ后成慢性炎癥狀態(tài),但兩組的炎癥因子有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異�？傮w來(lái)看,抗Cs CyPA抗體對(duì)于早期的慢性炎癥發(fā)生有一定的抑制,可以減少炎癥因子分泌,但是6w時(shí)與PBS免疫組基本無(wú)差異。結(jié)論:1.不同物種間CyPA相似度較高,抗Cs CyPA抗體可與小鼠CyPA產(chǎn)生免疫交叉反應(yīng),有效抑制CyPA的PPIase酶活性。2.抗Cs CyPA抗體對(duì)于小鼠膿毒癥有較好的治療作用,通過(guò)減輕炎癥反應(yīng),抑制DIC,保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等多方面發(fā)揮保護(hù)作用,從而降低死亡率。3.Cs CyPA免疫小鼠對(duì)于STZ造成的胰島β細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用。小鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量及胰島素分泌量都有一定保留,機(jī)體慢性持續(xù)炎癥反應(yīng)改善。
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R532.23
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本文編號(hào)：1214955