本文關(guān)鍵詞：中間宿主釘螺和釘螺間日本血吸蟲的遺傳關(guān)系

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【摘要】：目的:血吸蟲病是一種流行廣泛、嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病,而我國(guó)屬于血吸蟲病流行最嚴(yán)重國(guó)家之一。我國(guó)血吸蟲病的流行現(xiàn)主要局限于水位難以控制的湖沼地區(qū)和山區(qū)。血吸蟲因生態(tài)環(huán)境(如終宿主)不同或選擇壓力(如化療)而形成相應(yīng)的血吸蟲亞群或株,而其傳播流行可通過(guò)群體遺傳學(xué)方法進(jìn)行分析。群體遺傳學(xué)方法在血吸蟲上已有廣泛研究,然而多側(cè)重于地區(qū)間或終宿主間的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析,而有關(guān)中間宿主體內(nèi)和中間宿主間血吸蟲個(gè)體間的遺傳關(guān)系較少。因此,本研究以前期研究的山區(qū)型血吸蟲病流行區(qū)為現(xiàn)場(chǎng),通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查感染性釘螺,室內(nèi)逸出尾蚴感染小鼠收集蟲體,利用微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)蟲體進(jìn)行基因分型,進(jìn)而分析血吸蟲群體遺傳多樣性及釘螺內(nèi)和釘螺間血吸蟲的親緣關(guān)系,有助于深入了解血吸蟲的傳播特征,為建立血吸蟲病傳播動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型提供參數(shù),同時(shí)為有效地控制血吸蟲病流行提供新思路。方法:從已發(fā)表文章中選擇17對(duì)多態(tài)性較好、適用于本研究的微衛(wèi)星引物,對(duì)這些引物進(jìn)行同一體系和PCR反應(yīng)條件擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增不好的引物進(jìn)行溫度梯度PCR擴(kuò)增,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè),確定各自最佳退火溫度。舍棄擴(kuò)增不好的引物,運(yùn)用余下引物對(duì)3只釘螺的41份血吸蟲樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增、瓊脂糖電泳檢測(cè)、檢測(cè)片段大小,將結(jié)果整理成基因型數(shù)據(jù)�；谘x個(gè)體基因型,檢測(cè)每對(duì)引物是否能將來(lái)自不同釘螺的血吸蟲個(gè)體鑒別開。舍棄鑒別失敗的引物,最終確定用于研究血吸蟲遺傳關(guān)系的微衛(wèi)星引物。將從血吸蟲病流行現(xiàn)場(chǎng)(安徽石臺(tái)地區(qū))采集到的釘螺帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行逸蚴實(shí)驗(yàn),鑒別陽(yáng)性釘螺。將陽(yáng)性釘螺逸出的尾蚴感染小鼠,收集血吸蟲成蟲。運(yùn)用最終確定的微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)血吸蟲成蟲進(jìn)行基因分型。對(duì)血吸蟲基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析前,利用GENECAP 1.2.2剔除釘螺內(nèi)相同基因型的血吸蟲。接著利用FSTAT 2.9.3進(jìn)行群體遺傳多樣性分析,包括各位點(diǎn)等位基因數(shù)目、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)目、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和近交系數(shù)(Fis)及其標(biāo)準(zhǔn)差,各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)懫用相關(guān)公式計(jì)算;對(duì)各位點(diǎn)利用GENEPOP 4.0進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn);對(duì)釘螺間血吸蟲基因型分布進(jìn)行Poisson分布擬合優(yōu)度檢驗(yàn)(x2檢驗(yàn))。利用SPAGe Di 1.3軟件計(jì)算釘螺內(nèi)和釘螺間日本血吸蟲親緣關(guān)系系數(shù);利用Colony 2.0進(jìn)行胞系分析,推斷釘螺內(nèi)和釘螺間日本血吸蟲的胞系關(guān)系。結(jié)果:1.現(xiàn)場(chǎng)采集8563只釘螺,篩選得到67只陽(yáng)性釘螺。陽(yáng)性釘螺經(jīng)逸蚴實(shí)驗(yàn),最終成功感染46只小鼠,收集到472條血吸蟲成蟲。經(jīng)過(guò)引物篩選和條件優(yōu)化,最終確定12對(duì)微衛(wèi)星引物。12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)從4到25個(gè)不等,平均每個(gè)位點(diǎn)上含有16.7個(gè)等位基因。有效等位基因數(shù)的范圍為1.103-1.922。12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度范圍為0.005-0.914,平均為0.633;而期望雜合度的范圍為0.057-0.557,平均為0.437;多態(tài)信息含量的范圍為0.1-0.914,平均為0.743,除sjp4和sjp22之外,其余10個(gè)位點(diǎn)多態(tài)信息含量均大于0.5。本研究初步認(rèn)為篩選出的12對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記適用于日本血吸蟲,可以作為其遺傳學(xué)研究的良好標(biāo)記。2.12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)近交系數(shù)(Fis)的范圍為-0.709-0.779,平均值為-0.365,表明:sjp22位點(diǎn)雜合子缺失(Fis0),其余11個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)為雜合子過(guò)剩(Fis0)。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)表明12個(gè)位點(diǎn)中只有3個(gè)位點(diǎn)(sjp32,sjp42,sjp63)符合此平衡(P0.05),其余均偏離Hardy-Weinberg平衡(P0.05)。Poisson分布擬合優(yōu)度檢驗(yàn)顯示,釘螺間血吸蟲基因型分布呈過(guò)度分布(P0.005),其中21%的釘螺含有單基因型,其余含有多種基因型。3.日本血吸蟲親緣關(guān)系分析結(jié)果為:12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的親緣關(guān)系系數(shù)范圍為0.030-0.866,平均值為0.723;205條血吸蟲親緣關(guān)系系數(shù)為0.164(±0.159);46只釘螺內(nèi)日本血吸蟲親緣關(guān)系系數(shù)為0.670(±0.240);46只釘螺間日本血吸蟲親緣關(guān)系系數(shù)為0.150(±0.131)。表明釘螺內(nèi)的血吸蟲親緣關(guān)系較近,釘螺間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。4.在兩種錯(cuò)誤率(1%和2%)設(shè)置條件下進(jìn)行Colony分析,發(fā)現(xiàn)家系結(jié)構(gòu)基本無(wú)差別,釘螺內(nèi)的家系結(jié)構(gòu)為:7只釘螺,其體內(nèi)血吸蟲分別來(lái)源于2個(gè)家系,其中螺A3P2和螺C3P1為混合感染(mixed-sex infection),雌蟲和雄蟲分別來(lái)自不同家系;1只釘螺(螺C6P3),其血吸蟲來(lái)源于3個(gè)家系,其余38只釘螺均只有1個(gè)家系,且為單性感染;釘螺間的家系結(jié)構(gòu)為,205條血吸蟲成蟲來(lái)自于53個(gè)家系,每個(gè)家系血吸蟲數(shù)目范圍為1-15條,3個(gè)家系分別感染兩只釘螺,其余家系均感染單只釘螺。結(jié)果表明:一只釘螺內(nèi)的日本血吸蟲大多為同胞關(guān)系,即它們來(lái)自于同一家系,而不同的血吸蟲家系多感染不同釘螺。結(jié)論:1.本研究初步確定了用于日本血吸蟲親緣關(guān)系研究的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn):sjp1,sjp4,sjp18,sjp22,sjp28,sjp32,sjp34,sjp42,sjp45,sjp54,sjp60,sjp63。2.多數(shù)釘螺被一個(gè)家系感染,少數(shù)被多個(gè)家系(螺A2P1,A3P2,A6P3,B4P3,C1P4,C3P1,C6P3,D4P3)感染,且螺A3P2、C3P1為混合感染。前者提示螺點(diǎn)終宿主活動(dòng)不多,具有一定的傳播意義,后者提示終宿主種類較多或者活動(dòng)較為頻繁,傳播意義較強(qiáng)。其中,混合感染釘螺A3P2、C3P1的傳播意義最強(qiáng)。3.釘螺內(nèi)的日本血吸蟲親緣關(guān)系近,釘螺間的親緣關(guān)系遠(yuǎn),可能與小空間內(nèi)血吸蟲幼蟲的空間聚集作用、釘螺內(nèi)血吸蟲感染引起的伴隨免疫及釘螺內(nèi)血吸蟲親緣選擇有關(guān)。4.親緣關(guān)系和胞系分析有助于深入了解血吸蟲在中間宿主間的傳播特征,為建立血吸蟲病傳播動(dòng)力學(xué)模型提供參數(shù),同時(shí)為進(jìn)一步有效控制血吸蟲病流行提供新思路。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R532.21

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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本文編號(hào)：1188071