本文關(guān)鍵詞：表達ppe25、ppe27基因重組恥垢分枝桿菌的免疫生物學(xué)特性研究

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【摘要】：結(jié)核病(tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)引起的一種以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病,目前全球約有1/3的人感染結(jié)核分枝桿菌。目前用于結(jié)核病預(yù)防的卡介苗(BCG),只能對兒童肺結(jié)核起到有效的保護,對成人的保護效果不盡如人意。PE/PPE蛋白家族其編碼基因大約占整個結(jié)核分枝桿菌基因組的10%,這些蛋白被認為是參與宿主免疫的毒力因子,它們只存在于致病的分枝桿菌中,預(yù)示著PE/PPE蛋白在該菌致病中可能發(fā)揮重要作用,但大部分PE/PPE蛋白的確切功能亟待闡明。本研究利用恥垢分枝桿菌表達結(jié)核分枝桿菌PPE25和PPE27蛋白,以初步探究其生化特性,與巨噬細胞的相互作用及其免疫特性,為結(jié)核病新型疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。1.表達PPe25和PPe27基因重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建及鑒定以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組為模板,采用PCR技術(shù)擴增ppe25和ppe27基因序列并添加FLAG標簽,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMV261-ppe25-flag和pMV261-ppe27-flag,經(jīng)測序鑒定正確后,將兩個重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌mc2155感受態(tài),PCR鑒定表明重組菌M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)構(gòu)建成功。重組菌經(jīng)45℃ 30min誘導(dǎo)表達后,Western blotting結(jié)果表明,表達的融合蛋白PPE25和PPE27與抗FLAG標簽單克隆抗體發(fā)生特異性的反應(yīng),與預(yù)期條帶大小39.51 kD和37.9 kD一致。2.表達PPe25和PPe27基因重組恥垢分枝桿菌生化特性的研究利用7H9培養(yǎng)恥垢分枝桿菌及重組恥垢分枝桿菌,繪制生長曲線,結(jié)果表明重組恥垢分枝桿菌與親本菌株相比生長速率無明顯變化。為了研究PPE25和PPE27蛋白是否與結(jié)核分枝桿菌應(yīng)對多種壓力環(huán)境能力有關(guān),檢測重組菌在SDS表面壓力和饑餓條件等體外壓力環(huán)境下生長情況。實驗證明PPE25和PPE27蛋白定位在細胞表面,增加了對饑餓條件和表面壓力環(huán)境的耐受,但對酸性環(huán)境更加敏感。實驗還同時檢測了重組菌M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)在巨噬細胞內(nèi)的生存情況及對巨噬細胞的影響。研究證明PPE25和PPE27蛋白明顯增強恥垢分枝桿菌在巨噬細胞內(nèi)的存活,并且引起巨噬細胞明顯的凋亡和細胞壞死(p0.05)。3.表達ppe25和ppe27基因重組恥垢分枝桿菌的免疫生物學(xué)特性研究將重組恥垢分枝桿菌M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)分別尾部皮下免疫6周齡BALB/c小鼠,免疫劑量為5×107CFU/只,免疫2周后進行二免,4周后測定重組恥垢分枝桿菌在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。ELISA檢測免疫小鼠血清抗體水平,結(jié)果表明重組菌M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)免疫組能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對PPE25. PPE27蛋白以及PPE25/27:56-71多肽的特異性抗體�？贵w亞類測定表明,M.S.(pMV261-ppe25-flag)和M.S.(pMV261-ppe27-flag)以產(chǎn)生IgG1為主。分離小鼠淋巴細胞,利用Brdu法檢測淋巴細胞抗原特異性增殖指數(shù)(SI),結(jié)果顯示,以PPE25、PPE27和PPE25/27:44-52多肽刺激均能使免疫小鼠淋巴細胞發(fā)生增殖(p0.05)。研究中還檢測了免疫小鼠淋巴細胞分泌Thl型細胞因子TNF、IL-2和IFN-y, Th2型細胞因子IL-4、 IL-6和IL-10。結(jié)果PPE27刺激M.S.(pMV261-ppe27-flag)免疫小鼠淋巴細胞分泌IL-4和IL-6高于對照組(p0.05),免疫類型偏向Th2型。上述研究結(jié)果為PPE25和PPE27蛋白在結(jié)核病疫苗研發(fā)等奠定了重要基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R52

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1 徐苗,陳保文,沈小兵,蘇城,羅永艾,王國治;恥垢分枝桿菌作為免疫調(diào)節(jié)劑的研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2005年09期

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本文編號：1182036