本文關(guān)鍵詞：華南部分地區(qū)家豬流行性乙型腦炎病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查

  更多相關(guān)文章： 豬 流行性乙型腦炎病毒 血清抗體 ELISA試劑盒 RT-PCT 流行病學(xué)調(diào)查

【摘要】：研究背景和目的流行性乙型病毒性腦炎(Epidemic encephalitis B,簡稱乙型腦炎或乙腦),又稱日本腦炎(Japanese encephalitis, JE),屬于自然疫源性疾病,可導(dǎo)致人、豬、馬發(fā)病,嚴(yán)重可死亡。乙腦的病原體為流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV,簡稱乙腦病毒)。乙腦病毒屬于黃熱病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)病毒,為單股正鏈RNA病毒,長約11kb。病毒RNA只含有一個(gè)開放閱讀框架(open reading frame, ORF),編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C蛋白、PrM/M蛋白、E蛋白)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、 NS4b、NS5)。根據(jù)E基因區(qū)核苷酸序列,將乙腦病毒劃分為分五個(gè)基因型(GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ、GⅤ)。2000年之前,GⅢ型是我國乙腦主要流行型；2001-2005年期間,GⅠ型和GⅢ型乙腦病毒混合流行；2005年之后則以GⅠ型為主要的流行型。乙腦在世界許多國家均有流行,但主要分布在亞洲,我國是高發(fā)地區(qū)之一,全國除了青海以外的省、直轄市均有乙腦病例的報(bào)道,局部地區(qū)時(shí)有暴發(fā)或者流行。豬是乙腦病毒重要的宿主,是人間乙腦的主要傳染源,三帶喙庫蚊是主要傳播媒介,乙腦病毒在豬-蚊-豬中存在一個(gè)基本的自然傳播模式,或存在鳥-蚊-鳥自然傳播模式,人偶然受到感染,是終末宿主。我國家豬飼養(yǎng)數(shù)量大,分布廣,分散程度高,更新率高,蚊媒密度亦高,存在乙腦病毒傳播的條件,如果不加以控制,乙腦病毒會(huì)長期在豬-蚊-豬中循環(huán),威脅人類的健康。在乙腦疫苗未在人群中廣泛應(yīng)用的年代,豬血清乙腦病毒抗體達(dá)到50%時(shí),3-4周后將出現(xiàn)人間乙腦發(fā)病的高峰,故進(jìn)行豬的乙腦病毒感染流行病學(xué)監(jiān)測可在一定程度上預(yù)測人間乙腦的發(fā)病情況。乙腦的預(yù)防,不僅有賴于降低人群易感性、消滅傳播媒介,也要做好傳染源的管理,做好源頭控制。因此,了解流行季節(jié)家豬乙腦病毒感染情況,有利于充分掌握當(dāng)前乙腦的流行因素,科學(xué)地做好乙腦的預(yù)防和控制工作。因此,本研究在華南部分地區(qū)對(duì)成年家豬乙腦病毒的帶毒和血清抗體開展調(diào)查,了解家豬間乙腦的流行狀況,以便為乙腦的防制提供科學(xué)信息。鑒于目前我國市場上的商品化豬JEV IgG抗體E LISA檢測試劑盒品牌眾多,質(zhì)量參差不齊,給應(yīng)用者選擇帶來了一定的困難,我們?cè)诒狙芯恐幸矊?duì)目前國產(chǎn)主要商品化IgG抗體ELISA試劑盒的真實(shí)性和可靠性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。研究方法1.豬血樣本的采集與處理2013年1月至8月期間,赴廣東省、海南省和江西省部分地區(qū)的屠宰場或肉聯(lián)廠無菌采集6-8月齡表觀健康、未行乙腦疫苗免疫的家豬的血液樣本。所有采集到的豬血液樣本3000r/min離心15min,取離心后的血清混勻平均分裝,一式3份,冰袋或者干冰運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室后,-80℃保存待檢。2.豬乙腦病毒IgG抗體診斷試劑盒評(píng)價(jià)選用三種常用的商品化豬JEV IgG抗體ELISA試劑盒(Keqian、Lvshiyuan及Tianchen),以微量中和試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn),對(duì)90份豬血清進(jìn)行平行檢測,對(duì)結(jié)果進(jìn)行診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)。ELISA試劑盒的檢測嚴(yán)格按照各自說明書進(jìn)行操作,微量中和試驗(yàn)嚴(yán)格按照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS214-2008的指導(dǎo)進(jìn)行操作。3.豬乙腦病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查3.1豬血清乙腦病毒檢測和分離3.1.1 ELISA方法初篩豬血清樣本乙腦病毒抗原陽性標(biāo)本用商用豬血清JEV-Ag ELISA試劑盒初篩豬血清樣本,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。陽性者進(jìn)一步進(jìn)行病毒增殖和分離。3.1.2染毒BHK-21細(xì)胞單層乳倉鼠腎(Baby Hamster Syrian Kidney, BHK-21)細(xì)胞分別接種ELISA初篩為抗原陽性的豬血清樣本,Minimum Essential Medium培養(yǎng)基(MEM)液為空白對(duì)照。持續(xù)觀察7天后收集細(xì)胞病毒液,-80℃冰箱凍存待檢。期間,若出現(xiàn)疑似細(xì)胞病變的現(xiàn)象,如細(xì)胞死亡或出現(xiàn)變圓、脫落、聚集等形態(tài)改變,初步判為陽性。若無細(xì)胞形態(tài)改變或改變不明顯,盲傳三代,如仍未有形態(tài)改變,且TaqMan Real-time PCR檢測為陰性,則判為陰性。3.1.3類中和試驗(yàn)將10倍稀釋的可疑陽性樣本與不同濃度的豬乙腦病毒IgG抗體等體積混合,37℃孵育1h后接種至BHK-21細(xì)胞,乙腦病毒中山株(Nakayama)為陽性對(duì)照,MEM液為空白對(duì)照。37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天,每天記錄細(xì)胞病變情況,觀察豬乙腦病毒IgG抗體對(duì)可疑病毒的保護(hù)作用。3.1.4可疑病毒增殖將經(jīng)上述篩選過程判斷為可疑乙腦病毒陽性標(biāo)本(JH12、JH33、HK121、 HK151、HK212)過濾后染毒BHK-21細(xì)胞,盲傳三代,進(jìn)行細(xì)胞增殖。將細(xì)胞增殖病變液反復(fù)凍融3次,離心,過濾取上清液,和陽性對(duì)照(Nakayama株病毒液)、陰性對(duì)照(MEM液)一起,顱內(nèi)各接種一窩3日齡NIH乳鼠進(jìn)行病毒增殖,持續(xù)觀察2周。接種24h內(nèi)每2h觀察1次,24h后每天觀察3次。解剖瀕死小鼠,取部分腦組織于RNA late r保存,用于TaqMan Real-time PCR檢測乙腦病毒,另一部分腦組織用10%甲醛溶液固定后,制作病理切片,鏡下觀察病變情況。觀察期內(nèi)若無癥狀出現(xiàn),則連續(xù)盲傳三代,如仍未出現(xiàn)發(fā)病癥狀,且經(jīng)TaqMan Real-time PCR檢測后為陰性,則判斷為陰性。3.1.5 TaqMan Real-time PCR檢測可疑陽性樣本用Roche High Pure viral RNA kit提取可疑陽性樣本中的病毒RNA,再用Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的cDNA,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,用TaqMan Real-time PCR法檢測乙腦病毒(先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線)。3.1.6 TaqMan Real-time PCR檢測所有豬血清樣本當(dāng)上述流程未成功篩選分離出乙腦病毒時(shí),為避免中間環(huán)節(jié)可能出現(xiàn)的差錯(cuò),對(duì)所有豬血清樣本,統(tǒng)一提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再進(jìn)行Real-time RT-PC R檢測。3.2豬血清乙腦病毒IgG抗體檢測為保證研究進(jìn)度,在豬JEV IgG抗體ELISA試劑盒評(píng)價(jià)尚未完成之前,結(jié)合部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果、廠家信譽(yù)、市場占有率和價(jià)格進(jìn)行評(píng)估,選用Keqian豬JEV IgG抗體ELISA試劑盒,檢測全部465份豬血清樣本的JEV IgG抗體陽性情況。4.質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、準(zhǔn)備和實(shí)施的過程中,同時(shí)開展嚴(yán)格的質(zhì)量控制工作,遵守實(shí)驗(yàn)室安全守則,以保證實(shí)驗(yàn)科學(xué)、安全和順利進(jìn)行。研究結(jié)果1.豬血清樣本于2013年1月至8月期間,赴廣東省、海南省和江西省部分地區(qū)的屠宰場或肉聯(lián)廠收集當(dāng)?shù)?-8月齡表觀健康、未行乙腦疫苗免疫的家豬的血清樣本共465份。2.豬乙腦病毒IgG抗體診斷試劑盒評(píng)價(jià)2.1三種ELISA試劑盒檢測豬血清乙腦病毒IgG抗體的結(jié)果對(duì)90份豬血清標(biāo)本進(jìn)行檢測,微量中和試驗(yàn)的陽性檢出率為34.4%(31/90),Keqian、Lvshiyuan和Tianchen日性檢出率分別為50.0%(45/90)、47.8%(43/90)和38.9%(35/90)。與微量中和試驗(yàn)比較,靈敏度最高的是Keqia n,為90.32%,其特異度為71.19%,Tianchen的靈敏度和特異度分別為83.87%和79.66%,Lvshiyuan的靈敏度和特異度分別為41.94%和16.95%。與微量中和試驗(yàn)比較,Tianchen的K系數(shù)最高,為0.63；其次是Keqian,為0.57;Lvshiyuan僅為0.04。三種試劑盒同一批次檢測結(jié)果重復(fù)性高,即均有較高的批次內(nèi)穩(wěn)定性。3.豬乙腦病毒感染率3.1豬血清乙腦病毒檢測情況用上海瓦蘭生物有限公司生產(chǎn)的商用豬血清JEV-Ag ELISA試劑盒初篩465份豬血清樣本,共得到43份JEV抗原陽性樣本,陽性率9.25%。陽性標(biāo)本接種BHK-21細(xì)胞,24份染毒的細(xì)胞與陰性對(duì)照無明顯區(qū)別,19份樣本在接種第2天時(shí)開始陸續(xù)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡或細(xì)胞出現(xiàn)變圓、脫落、聚集等形態(tài)改變,部分呈菌落狀聚集病變。將出現(xiàn)病變的19份樣本過濾,重新染毒BHK-21細(xì)胞,三代盲傳,得到11份有持續(xù)致病變能力的可疑樣本。將11份可疑樣本與購買的乙腦病毒抗體一同進(jìn)行類中和試驗(yàn),有5份樣本能夠被乙腦病毒抗體保護(hù),分別命名為JH12、JH33、HK121、HK151和HK212。這5份可疑乙腦病毒陽性血清標(biāo)本接種乳鼠,乳鼠均于接種后20-30h內(nèi)死亡,接種同一樣本的同一窩乳鼠死亡時(shí)間差不超過3h,乳鼠死亡時(shí)無明顯特征反應(yīng)。但是,所有樣本用TaqMan Real-time PCR檢測均為乙腦病毒陰性。鑒于以上流程未成功分離到乙腦病毒,為避免中間環(huán)節(jié)可能出現(xiàn)的差錯(cuò),將所有豬血清樣本統(tǒng)一提取RNA進(jìn)行Real-time PCR檢測,部分血清量不夠用于提取RNA的樣本(200μ1)未納入檢測。合計(jì)檢測437份豬血清樣本乙腦病毒特異性核酸,Real-time PCR檢測未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。3.2豬血清乙腦病毒IgG抗體檢測結(jié)果ELISA方法(Keqian,生產(chǎn)批號(hào)為131005)檢測465份豬血清樣本,JEV IgG抗體檢出率高達(dá)95.7%,其中7、8月采集的豬血清樣本的檢出率近乎100%。不同生產(chǎn)批號(hào)(130101和131005)試劑盒檢測的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.04,P0.001),K系數(shù)等于0.378。研究結(jié)論1.目前國內(nèi)商品化豬JEV IgG抗體ELISA檢測試劑盒診斷結(jié)果差異較大；與微量中和試驗(yàn)相比,存在較高的假陽性率。說明試劑盒質(zhì)量有待提高。2.對(duì)廣東省、海南省和江西省當(dāng)?shù)?-8月齡表觀健康、未行乙腦疫苗免疫的家豬的血清樣本進(jìn)行乙腦病毒攜帶檢測,乙腦病毒陽性率為9.25%,但未檢測到乙腦病毒核酸,也未分離到乙腦病毒株；乙腦病毒IgG抗體陽性率高達(dá)95.7%。結(jié)果提示廣東、海南和江西成年家豬中乙腦病毒感染高,應(yīng)引起高度重視。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.32

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳孝明;亓文寶;張桂紅;臧富玉;陳金頂;廖明;;廣東省部分規(guī)模化豬場乙腦抗體的監(jiān)測與分析[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年09期

2 程振濤;陳軍義;岳筠;周碧君;文明;王開功;隆華;李敬丹;;貴州省豬乙型腦炎血清流行病學(xué)調(diào)查[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2011年12期

，

本文編號(hào)：1165705