本文關鍵詞：結核分枝桿菌人新B細胞表位及10種特異蛋白的抗原性研究

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【摘要】：在結核病(Tuberculosis,TB)的免疫學研究中,特異抗原及其抗原表位的研究對結核病的診斷技術和疫苗發(fā)展具有極為重要的作用。抗原表位是決定抗原特異性和免疫效能的特殊基團或空間結構。B細胞表位在感染免疫中發(fā)揮了重要作用,如激活體液免疫應答和調節(jié)細胞免疫應答。因此,研究抗原B細胞表位,有助于結核病快速診斷試劑和疫苗的研究。本研究一是開展結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)新抗原的B細胞表位預測和篩選,二是選取抗原表位數(shù)較多的特異性抗原進行克隆表達純化,并對純化的重組蛋白及B表位多肽進行血清學評價,為研發(fā)結核病特異診斷試劑和新疫苗提供基礎。根據(jù)基因組學、蛋白質組學、免疫組學和生物信息學原理,排除PE/PPE蛋白、轉座子基因以及已知B表位的蛋白抗原,從結核分枝桿菌全基因組的蛋白質基因序列中篩選新的蛋白抗原。利用生物信息學和SEPPA2.0軟件,預測新抗原的B細胞表位,分析、優(yōu)選并合成B細胞表位多肽。閱讀文獻、根據(jù)美國國立生物技術信息中心(NCBI)和免疫表位數(shù)據(jù)庫(IEDB),分析并選擇有抗原表位的結核分枝桿菌特異性抗原。蛋白抗原的編碼基因以標準株H37Rv的DNA為模板,PCR擴增并提取目的基因,以原核表達載體PET32a構建重組質粒,雙酶切鑒定和測序100%正確的重組子進行誘導表達,SDS-PAGE分析鑒定。大量誘導后鎳離子親和層析柱層析純化,純化效果不理想的蛋白再次使用純化試劑盒進行純化。純化后的包涵體進行復性,使用BCA法對蛋白的濃度進行測定。將合成的B細胞表位多肽及純化后的蛋白包被酶標板,棋盤滴定法確定抗原及多肽、一抗和二抗的最佳稀釋度,以結核病人血清及健康志愿者的血清為一抗,間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對B細胞表位多肽及重組蛋白抗原進行評價。本研究經過軟件的預測及篩選,成功預測并合成了結核分枝桿菌3個新蛋白的共13條B細胞線性表位多肽,包括蛋白Sod C成功合成3條,Mog為4條和Rv1566c為6條,每條多肽的純度大于90%,滿足實驗要求。Mog抗原成功預測了構象表位,構象表位需要通過重組蛋白的克隆表達,再進行血清學驗證。本研究通過文獻檢索及生物信息學篩選,確定了9個已知特異性蛋白抗原,并完成了此九種蛋白及構象表位抗原Mog的克隆表達純化,酶切鑒定結果正確,測序結果與NCBI中的序列完全一致。10種蛋白的誘導表達純化,最終得到了純化效果較理想的重組蛋白。間接ELISA法對B表位多肽及10種蛋白抗原進行評價,棋盤滴定確定多肽的包被濃度為3.13μg/ml,蛋白抗原Pfk B、Rv2628、Rv2653c、Mpt83、Mpt70、Lppx、Esx R、Fad D28、Dev S和Mog的最佳包被濃度分別為0.46μg/ml、1.03μg/ml、1.31μg/ml、1.53μg/ml、1.20μg/ml、1.15μg/ml、5.53μg/ml、0.85μg/ml、1.08μg/ml和1.65μg/ml。血清的最佳稀釋度Pfk B為1:50,Esx R為1:400,Rv2628、Rv2653c、Mpt83、Mpt70、Lppx、Fad D28、Dev S、Mog及多肽的血清最佳稀釋度均為1:100。該實驗選取了104份陽性血清和104份陰性血清,ELISA法分別對10種蛋白抗原及13條多肽進行血清學評價。使用SPSS17.0軟件分析實驗數(shù)據(jù),Pfk B、Rv2628、Rv2653c、Mpt83、Mpt70、Lppx、Esx R、Fad D28、Dev S和Mog的靈敏度分別為73.08%、54.81%、58.65%、94.23%、79.81%、77.88%、92.31%、86.54%、91.35%、89.42%,特異度分別為90.57%、94.34%、87.74%、59.43%、86.79%、77.36%、62.26%、82.08%、83.96%、69.81%,ROC曲線下面積分別為0.882、0.789、0.773、0.825、0.884、0.851、0.822、0.891、0.870和0.901。除Rv2628、Rv2653c的Youden指數(shù)小于0.5外,其它蛋白的Youden指數(shù)均大于0.5,Mog的Youden指數(shù)最大為0.734。Sod C的3條B細胞表位多肽,靈敏度分別為88.46%、65.38%、72.12%,特異度為75.96%、91.35%和89.42%,ROC曲線下面積均大于0.85。Mog蛋白的4條B細胞表位多肽中P209的靈敏度、特異度最高,分別為88.46%、88.69%,ROC曲線下面積為0.934。Rv1566c的6條B細胞表位多肽,靈敏度范圍為77.88%~92.31%,特異度介于69.23%~85.58%,ROC曲線下面積均大于0.849。本研究成功地篩選出3個結核分枝桿菌新抗原,完成了3個新抗原的13條B細胞線性表位的預測、篩選及多肽的合成,新抗原Mog成功預測構象表位。構象表位Mog及9種已知的特異蛋白抗原完成了克隆、表達和純化。用血清學抗體檢測方法評價了結核分枝桿菌B細胞表位多肽及重組蛋白的抗原性。研究結果將為研制結核病特異診斷試劑和新疫苗提供依據(jù)。
【關鍵詞】：結核分枝桿菌 B細胞表位 重組蛋白 克隆表達 酶聯(lián)免疫吸附試驗
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R52
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-17
• 第1章 緒論17-20
• 技術路線19-20
• 第2章 新抗原人B細胞表位的預測合成及10種蛋白抗原的克隆表達純化20-57
• 2.1 實驗材料20-26
• 2.1.1 菌株及載體的來源20-21
• 2.1.2 主要試劑及材料21-22
• 2.1.3 主要試劑配制22-24
• 2.1.4 主要儀器設備24-25
• 2.1.5 主要生物信息學分析軟件25-26
• 2.2 實驗方法26-37
• 2.2.1 結核分枝桿菌新抗原的篩選、B細胞表位的預測優(yōu)選和合成以及已知特異抗原的篩選26
• 2.2.2 重組質粒的克隆表達26-34
• 2.2.3 重組蛋白大量的誘導表達、鑒定與純化34-35
• 2.2.4 純化包涵體的透析復性35-36
• 2.2.5 重組蛋白濃度的測定36-37
• 2.3 實驗結果37-51
• 2.3.1 新蛋白B細胞表位的預測、篩選及多肽的合成37-38
• 2.3.2 特異蛋白抗原編碼基因中人T/B細胞表位的分布情況38-39
• 2.3.3 目的基因的PCR擴增39
• 2.3.4 重組質粒的構建39-40
• 2.3.5 PCR陽性菌落的鑒定40-42
• 2.3.6 重組質粒的雙酶切鑒定42
• 2.3.7 重組質粒目的基因的測序結果42-45
• 2.3.8 重組質粒的小量誘導表達45-47
• 2.3.9 大量誘導后表達形式的驗證47-48
• 2.3.10 10種重組蛋白的純化48-49
• 2.3.11 BCA法蛋白濃度的測定結果49-51
• 2.4 討論51-57
• 第3章 蛋白抗原及多肽的血清學評價57-71
• 3.1 實驗材料57-58
• 3.1.1 血清標本來源57
• 3.1.2 試劑及材料57
• 3.1.3 主要試劑的配制57-58
• 3.1.4 主要儀器58
• 3.1.5 分析軟件58
• 3.2 血清學驗證方法58-61
• 3.2.1 棋盤滴定確定目的蛋白、多肽及血清的最佳稀釋度58-59
• 3.2.2 確定最佳二抗稀釋度59
• 3.2.3 待測血清標本的檢測59
• 3.2.4 數(shù)據(jù)分析59-61
• 3.3 實驗結果61-68
• 3.3.1 蛋白抗原及多肽最佳包被濃度及血清稀釋度61-63
• 3.3.2 二抗的最佳稀釋度63
• 3.3.3 蛋白抗原及多肽檢測待測血清的ELISA結果63-68
• 3.4 討論68-71
• 第4章 結論71-72
• 參考文獻72-76
• 文獻綜述 B細胞抗原表位的研究及在結核分枝桿菌血清學診斷中的應用76-90
• 參考文獻84-90
• 作者攻讀學位期間的學術成果90-91
• 致謝91

【參考文獻】

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本文編號：1082887