本文關(guān)鍵詞：2型豬鏈球菌組氨酸三聚體家族蛋白HtpsC與宿主細(xì)胞外基質(zhì)作用機理的研究

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【摘要】：豬鏈球菌(Streptococcus suis, S.suis)是一種重要的革蘭氏陽性致病菌,可致人獸共患病。到目前為止,有35個血清型被臨床檢出,其中2型豬鏈球菌(Streptococcus suis serotype 2, S.suis 2)臨床檢出率最高且毒力最強。近年來, S.suis2感染在世界許多國家盛行,尤其是1998年和2005年中國的2次大規(guī)模感染人事件的爆發(fā),導(dǎo)致國內(nèi)外罕見的鏈球菌中毒樣休克綜合癥(streptococcal toxic shock-like syndrome, STSLS),不僅造成巨大的經(jīng)濟損失而且造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件。因此,開展對S.suis 2感染機理的研究,對于預(yù)防和控制S.suis 2的致病性具有重要的意義。但是,目前關(guān)于S.suis 2感染、入侵宿主的機理尚不清楚。因此,進一步研究2型豬鏈球菌毒力因子與宿主相互作用的機理,對于了解和明確S.suis 2致病性具有重大意義。組氨酸三聚體家族蛋白(Histidine traid proteins, Htp)是一類新發(fā)現(xiàn)的鏈球菌表面蛋白家族,因其含有高度保守的、多次重復(fù)的組氨酸三聚體基序(His-x-x-His-x-His)而得名。目前所有發(fā)現(xiàn)的Htp蛋白都是由鏈球菌的致病性基因編碼�；谙到y(tǒng)發(fā)育關(guān)系及結(jié)構(gòu)組成,Htp蛋白可分為兩個亞家族：HTP Ⅰ和HTP Ⅱ.其中,2型豬鏈球菌S.suis 2的HtpsC及其同源物即化膿鏈球菌S.pyogenes的S1r和無乳鏈球菌S.agalactiae的B1r,均屬于HTP Ⅱ家族。它們的氨基酸序列具有典型的特征,即在其N端具有高度保守的、多次重復(fù)的組氨酸三聚體基序(His-x-x-His-x-His);在其C端具有高度保守、多次重復(fù)的亮氨酸重復(fù)序列LRRs結(jié)構(gòu)域。研究表明,Sir和Blr均屬于李斯特產(chǎn)單核細(xì)胞內(nèi)化素A相關(guān)的鏈球菌LRR蛋白家族,其中Sir已經(jīng)被證實能夠與宿主細(xì)胞外基質(zhì)ECM中的I型膠原相互作用,提示HTP Ⅱ家族蛋白能夠與宿主細(xì)胞外基質(zhì)作用進而發(fā)揮其致病性。在課題組前期的研究中,已經(jīng)證實htpsC基因是S.suis 2中重要的毒力因子,涉及S.suis 2的致病性、粘附。通常,細(xì)菌粘附、入侵宿主是通過細(xì)菌表面粘附素(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules, MSCRAMMs)與宿主細(xì)胞外基質(zhì)ECM之間的相互作用來完成的,病原菌與宿主ECM組分相互作用是細(xì)菌粘附、入侵宿主所普遍采取的機制。但是,迄今為止,還沒有關(guān)于S.suis 2中HtpsC與宿主細(xì)胞外基質(zhì)ECM作用機制的研究和報道。本研究通過對S.suis 2中國強毒株05ZYH33的htpsC基因序列分析,發(fā)現(xiàn)它含有2個高度保守的結(jié)構(gòu)域,即N端HTP結(jié)構(gòu)域和C端LRR結(jié)構(gòu)域。通過基因克隆、原核表達(dá)及純化獲得了重組HtpsC蛋白。通過與宿主細(xì)胞外基質(zhì)ECM組分的相互作用,證實HtpsC是S.suis 2表面的一個粘附素,且是一個纖連蛋白和層粘連蛋白結(jié)合蛋白,其功能是在S.suis 2感染宿主的過程中通過與宿主ECM纖連蛋白和層粘連蛋白的相互作用,從而介導(dǎo)細(xì)菌粘附宿主。本研究進一步地通過原核表達(dá)、純化獲得了rHTP和rLRR結(jié)構(gòu)域蛋白,并證實S.suis 2中HtpsC的N端HTP結(jié)構(gòu)域是一個層粘連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域,而其C端LRR結(jié)構(gòu)域是一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域,分別介導(dǎo)HtpsC在S.suis 2感染宿主時與宿主細(xì)胞外基質(zhì)層粘連蛋白和纖連蛋白的結(jié)合。菌體與宿主ECM的實驗表明,相比于野毒株,△htpsC對纖連蛋白的結(jié)合下降了40%,對層粘連蛋白的結(jié)合下降了30%。綜上所述,本研究鑒定了在S.suis 2感染宿主時,組氨酸三聚體家族蛋白HtpsC是S.suis 2表面的一個全新粘附素且是一個纖連蛋白和層粘連蛋白結(jié)合蛋白,在細(xì)菌感染、入侵宿主時通過與宿主細(xì)胞外基質(zhì)ECM相互作用,主要粘附宿主細(xì)胞外基質(zhì)纖連蛋白和層粘連蛋白,從而介導(dǎo)細(xì)菌粘附宿主。進一步地研究證明,其C端LRR結(jié)構(gòu)域是一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域,而其N端HTP結(jié)構(gòu)域是一個層粘連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。研究結(jié)果表明,在S.suis 2感染宿主的過程中,其C端LRR結(jié)構(gòu)域和N端HTP結(jié)構(gòu)域分別介導(dǎo)HtpsC與宿主細(xì)胞外基質(zhì)纖連蛋白和層粘連蛋白的結(jié)合,從而發(fā)揮其功能。
【關(guān)鍵詞】：2型豬鏈球菌 HtpsC HTP結(jié)構(gòu)域 LRR結(jié)構(gòu)域 宿主細(xì)胞外基質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R515
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 中英文縮寫一覽表7-12
• 第1章 緒論12-18
• 第2章 2型豬鏈球菌htpsC與宿主細(xì)胞外基質(zhì)作用的研究18-32
• 2.1 實驗材料和試劑18-21
• 2.1.1 實驗菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基19
• 2.1.2 主要試劑和儀器19-21
• 2.2 實驗方法21-24
• 2.2.1 S.suis 2 05ZYH33基因組htpsC基因序列分析21
• 2.2.2 htpsC基因的克隆和表達(dá)21-22
• 2.2.3 重組蛋白HtpsC的純化22
• 2.2.4 兔抗HtpsC多克隆抗體的制備22
• 2.2.5 Western blot分析兔抗HtpsC多克隆抗體22-23
• 2.2.6 重組HtpsC蛋白與宿主細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用23
• 2.2.7 菌體粘附宿主細(xì)胞外基質(zhì)ECM的鑒定23-24
• 2.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析24
• 2.3 結(jié)果24-31
• 2.3.1 S.suis 2 05ZYH33基因組htpsC序列分析24-25
• 2.3.2 獲得高純度的重組蛋白HtpsC25-26
• 2.3.3 獲得高效價的兔抗HtpsC多克隆抗體26
• 2.3.4 Western blot鑒定HtpsC與兔抗HtpsC多克隆抗體的反應(yīng)26-27
• 2.3.5 HtpsC是S.suis 2的一個表面粘附素,屬于微生物MSCRAMMs家族27-28
• 2.3.6 HtpsC是一個纖連蛋白和層粘連蛋白結(jié)合蛋白28-29
• 2.3.7 htpsC能夠介導(dǎo)S.suis 2粘附宿主纖連蛋白和層粘連蛋白29-31
• 2.4 討論31-32
• 第3章 HtpsC蛋白C端LRR結(jié)構(gòu)域功能的研究32-44
• 3.1 實驗材料和試劑32-33
• 3.1.1 實驗菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基32
• 3.1.2 主要試劑和儀器32-33
• 3.2 實驗方法33-37
• 3.2.1 S.suis 2 htpsC基因C端LRR結(jié)構(gòu)域(lrr)片段的引物設(shè)計33
• 3.2.2 lrr片段的PCR克隆33
• 3.2.3 lrr片段的T克隆33-34
• 3.2.4 重組表達(dá)載體pET28a-lrr的構(gòu)建與鑒定34
• 3.2.5 重組結(jié)構(gòu)域蛋白rLRR的誘導(dǎo)表達(dá)與純化34-35
• 3.2.6 兔抗rLRR多克隆抗體的制備35-36
• 3.2.7 Western blot分析兔抗rLRR多克隆抗體36
• 3.2.8 rLRR蛋白與宿主細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用36-37
• 3.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析37
• 3.3 結(jié)果37-42
• 3.3.1 S.suis 2 htpsC基因C端lrr的編碼區(qū)設(shè)計特異性引物37
• 3.3.2 構(gòu)建pET28a-lrr重組表達(dá)載體37-38
• 3.3.3 獲得高純度的重組結(jié)構(gòu)域蛋白rLRR38-40
• 3.3.4 獲得高效價的兔抗rLRR多克隆抗體40
• 3.3.5 rLRR重組蛋白與兔抗rLRR多克隆抗體的反應(yīng)40-41
• 3.3.6 LRR結(jié)構(gòu)域能夠介導(dǎo)HtpsC與宿主細(xì)胞外基質(zhì)ECM結(jié)合41
• 3.3.7 LRR結(jié)構(gòu)域主要結(jié)合纖連蛋白41-42
• 3.4 討論42-44
• 第4章 HtpsC蛋白N端組氨酸三聚體結(jié)構(gòu)域功能的研究44-55
• 4.1 材料和試劑44
• 4.2 實驗方法44-48
• 4.2.1 S.suis 2 htpsC基因N端HTP結(jié)構(gòu)域(htp)片段的引物設(shè)計44
• 4.2.2 htp片段的PCR克隆44-45
• 4.2.3 htp片段的T克隆45
• 4.2.4 重組表達(dá)載體pET28a-htp的構(gòu)建與鑒定45-46
• 4.2.5 重組結(jié)構(gòu)域蛋白rHTP的誘導(dǎo)表達(dá)與純化46-47
• 4.2.6 兔抗rHTP多克隆抗體的制備47
• 4.2.7 Western blot分析兔抗rHTP多克隆抗體47
• 4.2.8 重組rHTP蛋白與宿主細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用47-48
• 4.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析48
• 4.3 結(jié)果48-53
• 4.3.1 S.suis2 htpsC基因N端htp的編碼區(qū)設(shè)計特異性引物48
• 4.3.2 構(gòu)建pET28a-htp重組表達(dá)載體48-49
• 4.3.3 獲得高純度的重組結(jié)構(gòu)域蛋白rHTP49-51
• 4.3.4 獲得高效價的兔抗rHTP多克隆抗體51
• 4.3.5 rHTP重組蛋白與兔抗rHTP多克隆抗體的反應(yīng)51
• 4.3.6 rHTP能夠介導(dǎo)HtpsC與宿主細(xì)胞外基質(zhì)ECM結(jié)合51-52
• 4.3.7 rHTP結(jié)構(gòu)域主要結(jié)合層粘連蛋白52-53
• 4.4 討論53-55
• 第5章 結(jié)論55-57
• 參考文獻57-65
• 碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文65-66
• 致謝66

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