本文關(guān)鍵詞：尚未傳入我國重要蟲媒病毒快速檢測方法的建立

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【摘要】：蟲媒病毒(arbovirus)是指通過吸血節(jié)肢動(dòng)物叮咬敏感的脊椎動(dòng)物而引起的自然疫源性疾病及人獸共患病的一組病毒。主要集中在披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)、黃病毒科(Flaviridae)黃病毒屬(Flavivirus)和布尼亞病毒科(Bunyaviridae)及呼腸孤病毒科(Reoviridae),如披膜病毒科甲病毒屬的巴馬哈森林病毒(Barmah Forest virus,BFV)、基孔肯尼亞病毒(Chikungunya virus,CHIKV)、東方馬腦炎病毒(Eastern equine encephal omyelitis virus,EEEV)、西方馬腦炎病毒(Western equine encephal omyelitis virus,WEEV)、羅斯河病毒(Ross river virus,RRV)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venzuelan Equine Encephal omyelitis virus,VEEV);黃病毒科(Flaviridae)黃病毒屬(Flaviviru)的黃熱病毒(Yellow fever virus,YFV)、昆津病毒(Kunjin virus,KUNV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)、西尼羅病毒(West Nile Virus,WNV)、圣路易斯腦炎病毒;布尼亞病毒科的拉克羅斯病毒(La Crosse virus,LACV)、雪靴野兔病毒(Snowshoe hare virus,SSH)、加利福尼亞腦炎血清組病毒(california encephalitis virus),塔希納病毒(Tahyna virus,TAHV)。昆蟲通過叮咬將病毒傳播給人、畜并引起疾病,不但會(huì)造成人類疾病和死亡,更易造成大批牲畜發(fā)病甚至死亡,帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失,已成為世界各國的公共衛(wèi)生問題。目前我國尚未分離到KUNV和BFV,但是存在有相關(guān)媒介蚊蟲,且具備WNV流行的生態(tài)學(xué)條件,KUNV作為WNV的一個(gè)亞種傳入中國的風(fēng)險(xiǎn)很大。目前也尚無YFV流行或確診的報(bào)道,但由于我國部分地區(qū)的地理、氣候、傳播媒介-蚊、傳染源-猴等條件與非洲、中、南美洲相似,并且隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,全球貿(mào)易一體化和都市化生活等趨勢,每年約有300萬以上旅行者出入YFV流行區(qū),這使得病毒和傳播媒介更易在各個(gè)國家之間傳播。蟲媒病毒為全世界分布,但主要分布在中溫帶、亞熱帶及熱帶。大多數(shù)的蟲媒病毒只分布于一個(gè)地區(qū)或是一個(gè)洲,但是可隨著人群的流動(dòng)、宿主和媒介的遷移而傳播至異地。因此我們應(yīng)加強(qiáng)入境醫(yī)學(xué)媒介攜帶蟲媒病毒的監(jiān)測和檢測。目前,蟲媒病毒的檢測主要有病毒分離法、血清學(xué)及分子生物學(xué)方法,但是這幾種方法都有各自的不足之處。病毒分離法雖是金標(biāo)準(zhǔn),但因其技術(shù)難度比較大,周期長,在實(shí)際工作中難以得到推廣和應(yīng)用。血清學(xué)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbent,elisa)檢測法,目前能用于蟲媒病毒檢測的商品化試劑數(shù)量較少,對(duì)于尚未傳入我國的蟲媒病毒則沒有相應(yīng)的全病毒抗體用于病毒抗原檢測,并且elisa用于抗體檢測的一個(gè)致命缺陷是由于同一病毒屬內(nèi)的病毒抗原性相似,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,因而限制了其廣泛應(yīng)用。近年來隨著pcr技術(shù)的推廣應(yīng)用,實(shí)時(shí)熒光pcr及常規(guī)反轉(zhuǎn)錄pcr擴(kuò)增(rt-pcr)在蚊媒體內(nèi)病毒的檢測方面被廣泛應(yīng)用。rt-pcr方法快速、敏感,能在5-8小時(shí)內(nèi)檢測到病毒,適合于口岸要求。本研究利用雙重rt-pcr及實(shí)時(shí)熒光rt-pcr技術(shù),建立快速、敏感、高特異性的檢測蟲媒病毒的方法,應(yīng)用于國境口岸蟲媒病毒的監(jiān)測及檢測。目的:本研究擬開展尚未傳入我國的重要蟲媒病毒,尤其是入境醫(yī)學(xué)媒介攜帶蟲媒病毒的快速檢測技術(shù)研究,建立同時(shí)能檢測kunv和bfv的雙重rt-pcr方法和分別建立kunv、yfv及bfv熒光rt-pcr檢測方法,并應(yīng)用于國境口岸蚊蟲媒介攜帶蟲媒病毒的檢測。方法:從genbank中檢索34株kunv,26株bfv,30株yfv全基因序列,通過dnastar軟件進(jìn)行序列比對(duì)和blast進(jìn)行保守序列搜索和分析,選擇kunv和bfv高度保守的e基因、yfv保守基因e基因?yàn)槟康幕?用primer5.0和beacondesigner7.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針。kunv和bfv的e基因序列委托上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成,再按照體外轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明提取kunv和bfv的rna,再反轉(zhuǎn)錄成cdna。用qiagen的rna提取試劑盒提取yfv的rna,建立kunv和bfv雙重rt-pcr檢測方法,分別建立kunv、bfv及yfv熒光rt-pcr檢測方法。結(jié)果:①建立了KUNV和BFV雙重RT-PCR方法,敏感性為KUNV:1.83×106copies/μL,BFV:2.02×106copies/μL,與LACV、SSH、MAYV、YFV、JEV均無交叉反應(yīng)。②建立了KUNV熒光RT-PCR方法,具有很好的特異性和靈敏性,敏感性為1.83×102copies/μL,與LACV、SSH、BFV、YFV、MAYV、JEV、和版納病毒(Banna virus,BAV)均無交叉反應(yīng)。③建立了BFV熒光RT-PCR方法,具有很好的靈敏性和特異性,敏感性為2.02×103copies/μL,與LACV、SSH、KUNV、MAYV、JEV、BAV、YFV均無交叉反應(yīng)。④建立了YFV熒光RT-PCR方法,具有很好的靈敏性和特異性,敏感性為1.4×103copies/μL,與LACV、SSH、KUNV、BFV、MAYV均無交叉反應(yīng)。結(jié)論:建立了KUNV和BFV雙重RT-PCR方法、KUNV、BFV及YFV熒光RT-PCR方法,對(duì)于口岸蚊傳蟲媒病毒檢測具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：昆津病毒 黃熱病毒 巴馬哈森林病毒 熒光RT-PCR 雙重RT-PCR
【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R51;R446
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-17
• 材料與方法17-24
• 結(jié)果24-28
• 附圖28-35
• 附表35-37
• 討論37-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-45
• 綜述45-53
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 致謝53-54
• 個(gè)人簡歷54

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