本文關鍵詞：一步反轉(zhuǎn)錄PCR技術在檢測4種人瘧原蟲中的初步應用

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【摘要】：目的探討應用一步反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術檢測4種人瘧原蟲的可行性和特異性。方法取惡性瘧(1例)、間日瘧(1例)、卵形瘧(1例)和三日瘧(5例)患者全血,提取瘧原蟲總RNA和基因組DNA。應用一步RT-PCR和一步實時熒光RT-PCR分別擴增經(jīng)脫氧核糖核酸酶(DNase)消化的瘧原蟲RNA樣品中的18S rRNA序列,應用普通PCR和一步RT-PCR技術分別擴增不同稀釋濃度的瘧原蟲RNA(未經(jīng)DNase消化和經(jīng)DNase消化)和DNA樣品中的瘧原蟲18S rRNA序列和18S r DNA序列,比較2種檢測技術可檢測到目標序列的樣品最低稀釋濃度。結(jié)果患者全血基因組DNA經(jīng)一步RT-PCR分別擴增出310、394和323 bp條帶,測序結(jié)果顯示分別為惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、卵形瘧原蟲(P.ovale)和間日瘧原蟲(P.vivax)的18S rRNA序列特異性條帶,但未擴增出三日瘧原蟲(P.malariare)特異條帶。一步實時熒光RT-PCR結(jié)果顯示,4種人瘧原蟲RNA樣品均出現(xiàn)相應的熒光信號,除三日瘧原蟲樣品外,各溶解曲線均僅有單一的擴增峰。因4種人瘧原蟲DNA和RNA原液樣品中模板量的差異,一步RT-PCR可檢測到的最低稀釋濃度從1至10-4不等,但可檢測到的DNA樣品的最低稀釋濃度與未經(jīng)DNase消化的RNA樣品相同或較后者低一個數(shù)量級,且兩者最低稀釋濃度均低于經(jīng)DNase消化的RNA樣品。與普通PCR的檢測結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),同一樣品均以一步RT-PCR可檢測到的稀釋濃度最低,較普通PCR的敏感性提高10~1 000倍。結(jié)論一步RT-PCR技術可檢測出人血液樣品中的惡性瘧原蟲、卵形瘧原蟲和間日瘧原蟲DNA,但在檢測三日瘧原蟲樣品中的適用性有待進一步分析。
【作者單位】： 中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所 世界衛(wèi)生組織熱帶病合作中心 科技部國家級熱帶病國際聯(lián)合中心 衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學重點實驗室;上海市疾病預防控制中心;安徽省疾病預防控制中心;
【關鍵詞】： 反轉(zhuǎn)錄PCR 瘧原蟲 核糖體小亞基
【基金】：寄生蟲病預防控制所防治技術儲備科研基金(No.CB-15006)~~
【分類號】：R531.3
【正文快照】： 隨著瘧疾發(fā)病率的持續(xù)下降,分子技術因其在檢測瘧原蟲中的重要作用被逐漸推廣并應用于低瘧區(qū)或無瘧區(qū)瘧疾檢測[1]。該法大多基于瘧原蟲屬(Plasmodium)及屬內(nèi)不同種類原蟲的小核糖體亞基基因(SSU r RNA或18S r RNA)保守區(qū)和種特異區(qū)序列而設計[2]。但同一種瘧原蟲基因組中含有

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本文編號：1048934