本文關(guān)鍵詞：Hsa-microRNA-218與顆粒溶素表達(dá)關(guān)系的探討

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【摘要】：目的：將顆粒溶素(Granulysin, GLS)表達(dá)質(zhì)粒與microRNA (miRNA)干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中,在細(xì)胞層面上觀察hsa-microRNA-218(miR-218)對(duì)GLS蛋白表達(dá)的干擾效果；應(yīng)用Taqman探針、qRT-PCR檢測(cè)miR-218在結(jié)核病(Tuberculosis, TB)人血清、血漿中的表達(dá)情況,為進(jìn)一步探討miR-218作為T(mén)B檢測(cè)生物標(biāo)志物在診斷結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染的應(yīng)用方面提供方法和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)(Flowcytometry, FCM)從外周血中篩選出CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞,用LV3-miR-218等包裝慢病毒感染后,Western-blot探討miR-218和GLS表達(dá)間的關(guān)系。方法：1.抽提佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetatefor, PMA)激活的THP-1細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增GLS基因,將其克隆至pDsRed-Express-Cl,構(gòu)建GLS表達(dá)質(zhì)粒pDsRed-GLS。將pDsRed-GLS與pGenesil-miR-218 (pGenesil-miR-control)共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞,36 h后激光共聚焦顯微鏡觀察兩種質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)情況,48 h后提取細(xì)胞總RNA和蛋白,RT-PCR和Western Blot檢測(cè)miR-218對(duì)GLS表達(dá)的影響。2.設(shè)計(jì)miR-218及內(nèi)參U6snRNA特異性逆轉(zhuǎn)錄引物及Taqman探針,抽提TB患者和健康人群對(duì)照組血清、血漿標(biāo)本中的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后,運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)miR-218的表達(dá)情況。同時(shí)比較miRNA專(zhuān)用提取試劑盒和TRIzol試劑在TB血清、血漿中抽提miR-218的效率；miR-218在TB血清和血漿中的含量；血清標(biāo)本經(jīng)預(yù)熱處理和10%SDS溶液預(yù)處理對(duì)抽提miR-218的影響。3.運(yùn)用FCM從TB患者和健康人群的外周血中分選出CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞,比較兩種細(xì)胞的比例和比值變化；qRT-PCR檢測(cè)miR-218在外周血CD4-T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)情況；慢病毒LV3-miR-218/LV3-miR-control、LV10-miR-218 inhibitor/ LV10-miR-control inhibitor感染CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞后,Western-blot探討miR-218和GLS表達(dá)間的關(guān)系。結(jié)果：1.酶切和測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組質(zhì)粒pDsRed-GLS構(gòu)建成功,且能與miRNA干擾質(zhì)粒在293 T細(xì)胞中共表達(dá)。與轉(zhuǎn)染pGenesil-miR-control組細(xì)胞相比,Western-Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pGenesil-miR-218組細(xì)胞的GLS蛋白表達(dá)下降約50%(P0.05),而GLS mRNA表達(dá)則無(wú)明顯變化(P0.05)。2.MiR-218在血清、血漿中都是穩(wěn)定存在的,可以被檢測(cè)出；miR-218在TB患者體內(nèi)的表達(dá)量是顯著升高的(P0.05),相較于血清,它在血漿中的含量更為豐富(P＜0.05); miRNA專(zhuān)用提取試劑盒提取miR-218的效率高于TRIzol試劑(P0.05)；對(duì)TB患者血清標(biāo)本進(jìn)行預(yù)熱或10%SDS溶液預(yù)處理后都能很好地提高抽提miR-218的效率,降低qRT-PCR檢測(cè)時(shí)的CT值(P0.05),兩種處理方法相比較,并無(wú)明顯差異(P0.05)。3.相較于健康人群,TB患者外周血中CD4+T細(xì)胞的比例降低(P0.05),CD8+T細(xì)胞的比例增高(P0.05),CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比值下降(P0.05):miR.218在TB患者外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)同健康人群對(duì)照組相比,沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1.MiR-218在轉(zhuǎn)錄后水平干擾了GLS的表達(dá)。2.MiR-218在TB患者體內(nèi)表達(dá)量顯著升高；Taqman探針結(jié)qRT-PCR技術(shù)適用于檢測(cè)TB血清、血漿中miR-218的表達(dá),血漿作為檢測(cè)標(biāo)本更佳；miRNA專(zhuān)用提取試劑盒、對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)熱或1 0%SDS溶液預(yù)處理都能很好提高提取血清、血漿中miR-218的效率。3.同正常人群相比,TB患者外周血中CD4+T細(xì)胞的比例降低,CD8’T細(xì)胞的比例增高,CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比值降低；miR-218在TB患者外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)同健康人群對(duì)照組相比,沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核病 顆粒溶素 miR-218 qRT-PCR 流式細(xì)胞術(shù)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R51
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-17
• 第一部分 細(xì)胞水平探討miR-218與顆粒溶素表達(dá)關(guān)系17-33
• 1 材料和方法17-27
• 2 結(jié)果27-31
• 3 討論31-32
• 4 小結(jié)32-33
• 第二部分 MiR-218在結(jié)核病血清、血漿中的檢測(cè)應(yīng)用33-41
• 1 材料和方法33-36
• 2 結(jié)果36-39
• 3 討論39-40
• 4 小結(jié)40-41
• 第三部分 臨床水平探討miR-218與顆粒溶素表達(dá)關(guān)系41-50
• 1 材料和方法41-45
• 2 結(jié)果45-48
• 3 討論48-49
• 4 小結(jié)49-50
• 全文小結(jié)50-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 文獻(xiàn)綜述55-68
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 致謝68-69
• 攻讀碩士期間發(fā)表學(xué)位論文69

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3 陳波;錢(qián)，

本文編號(hào)：1032091