發(fā)布時間：2017-10-14 16:32

  本文關鍵詞：Hsa-microRNA-218與顆粒溶素表達關系的探討

  更多相關文章： 結核病 顆粒溶素 miR-218 qRT-PCR 流式細胞術

【摘要】：目的：將顆粒溶素(Granulysin, GLS)表達質粒與microRNA (miRNA)干擾質粒共轉染入293T細胞中,在細胞層面上觀察hsa-microRNA-218(miR-218)對GLS蛋白表達的干擾效果；應用Taqman探針、qRT-PCR檢測miR-218在結核病(Tuberculosis, TB)人血清、血漿中的表達情況,為進一步探討miR-218作為TB檢測生物標志物在診斷結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染的應用方面提供方法和實驗基礎；運用流式細胞術(Flowcytometry, FCM)從外周血中篩選出CD4+T細胞、CD8+T細胞,用LV3-miR-218等包裝慢病毒感染后,Western-blot探討miR-218和GLS表達間的關系。方法：1.抽提佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetatefor, PMA)激活的THP-1細胞的總RNA,逆轉錄后PCR擴增GLS基因,將其克隆至pDsRed-Express-Cl,構建GLS表達質粒pDsRed-GLS。將pDsRed-GLS與pGenesil-miR-218 (pGenesil-miR-control)共轉染293 T細胞,36 h后激光共聚焦顯微鏡觀察兩種質粒在細胞中的表達情況,48 h后提取細胞總RNA和蛋白,RT-PCR和Western Blot檢測miR-218對GLS表達的影響。2.設計miR-218及內(nèi)參U6snRNA特異性逆轉錄引物及Taqman探針,抽提TB患者和健康人群對照組血清、血漿標本中的總RNA,逆轉錄反應后,運用qRT-PCR檢測miR-218的表達情況。同時比較miRNA專用提取試劑盒和TRIzol試劑在TB血清、血漿中抽提miR-218的效率；miR-218在TB血清和血漿中的含量；血清標本經(jīng)預熱處理和10%SDS溶液預處理對抽提miR-218的影響。3.運用FCM從TB患者和健康人群的外周血中分選出CD4+T細胞、CD8+T細胞,比較兩種細胞的比例和比值變化；qRT-PCR檢測miR-218在外周血CD4-T細胞、CD8+T細胞中的表達情況；慢病毒LV3-miR-218/LV3-miR-control、LV10-miR-218 inhibitor/ LV10-miR-control inhibitor感染CD4+T細胞、CD8+T細胞后,Western-blot探討miR-218和GLS表達間的關系。結果：1.酶切和測序結果證實重組質粒pDsRed-GLS構建成功,且能與miRNA干擾質粒在293 T細胞中共表達。與轉染pGenesil-miR-control組細胞相比,Western-Blot結果顯示轉染pGenesil-miR-218組細胞的GLS蛋白表達下降約50%(P0.05),而GLS mRNA表達則無明顯變化(P0.05)。2.MiR-218在血清、血漿中都是穩(wěn)定存在的,可以被檢測出；miR-218在TB患者體內(nèi)的表達量是顯著升高的(P0.05),相較于血清,它在血漿中的含量更為豐富(P＜0.05); miRNA專用提取試劑盒提取miR-218的效率高于TRIzol試劑(P0.05)；對TB患者血清標本進行預熱或10%SDS溶液預處理后都能很好地提高抽提miR-218的效率,降低qRT-PCR檢測時的CT值(P0.05),兩種處理方法相比較,并無明顯差異(P0.05)。3.相較于健康人群,TB患者外周血中CD4+T細胞的比例降低(P0.05),CD8+T細胞的比例增高(P0.05),CD4+T細胞與CD8+T細胞的比值下降(P0.05):miR.218在TB患者外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞中的表達同健康人群對照組相比,沒有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論：1.MiR-218在轉錄后水平干擾了GLS的表達。2.MiR-218在TB患者體內(nèi)表達量顯著升高；Taqman探針結qRT-PCR技術適用于檢測TB血清、血漿中miR-218的表達,血漿作為檢測標本更佳；miRNA專用提取試劑盒、對標本進行預熱或1 0%SDS溶液預處理都能很好提高提取血清、血漿中miR-218的效率。3.同正常人群相比,TB患者外周血中CD4+T細胞的比例降低,CD8’T細胞的比例增高,CD4+T細胞與CD8+T細胞的比值降低；miR-218在TB患者外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞中的表達同健康人群對照組相比,沒有顯著統(tǒng)計學意義。
【關鍵詞】：結核病 顆粒溶素 miR-218 qRT-PCR 流式細胞術
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R51
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-17
• 第一部分 細胞水平探討miR-218與顆粒溶素表達關系17-33
• 1 材料和方法17-27
• 2 結果27-31
• 3 討論31-32
• 4 小結32-33
• 第二部分 MiR-218在結核病血清、血漿中的檢測應用33-41
• 1 材料和方法33-36
• 2 結果36-39
• 3 討論39-40
• 4 小結40-41
• 第三部分 臨床水平探討miR-218與顆粒溶素表達關系41-50
• 1 材料和方法41-45
• 2 結果45-48
• 3 討論48-49
• 4 小結49-50
• 全文小結50-51
• 參考文獻51-55
• 文獻綜述55-68
• 參考文獻62-68
• 致謝68-69
• 攻讀碩士期間發(fā)表學位論文69

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2 楊愛龍;李芳秋;;顆粒溶素[A];第十屆全軍檢驗醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2005年

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本文編號：1032091