瘧疾廣泛流行、嚴重危害人類的健康，每年全球發(fā)病人數(shù)達億之多，其中我國有數(shù)拾萬，主要是間日瘧。敏感特異的瘧疾診新和有效的流行病學監(jiān)測是瘧疾防治的必要前提。長期以來，瘧疾的診斷依賴于涂血片鏡撿的方法，費時費力，不適用于大樣本的流行病學調(diào)查。免疫學方法的特異性和穩(wěn)定性較差，尤其不能鑒別有瘧史的和現(xiàn)癥患者，使其應用受到限制。 基因工程技術的問世有力地推動了瘧疾診斷技術的發(fā)展，用瘧原蟲DNA探針作瘧疾的基因診斷，具有高度的敏感性和特異性，尤其適用于瘧疾流行病學調(diào)查和瘧原蟲分子水平上的種株分類。瘧原蟲DNA探針的來源主要有三種：基因組DNA，重組質(zhì)粒和合成的寡核苷酸片段。其中，前者的特異性差，后者的成本高，重組質(zhì)粒DNA最為適用。目前，在瘧疾基因診斷的研究中，由于取材困難，研制間日瘧原蟲(Plasmodium vivax，Pv)DNA探針的報道極少，惡性瘧

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【學位級別】：博士

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文獻回顧
    一、瘧原蟲DNA文庫構(gòu)建的研究概況
        (一) 瘧原蟲基因組的特征
        (二) 目的DNA的制備和載體的選擇
        (三) 瘧原蟲基因的克隆與篩選
        (四) 瘧原蟲特異性DNA片段的篩選
    二、瘧原蟲核酸探針的制備與應用
        (一) 瘧原蟲核酸探針的制備
        (二) 用核酸探針診斷瘧疾
        (三) 用核酸探針鑒別瘧原蟲株
前言
第一部分 間日瘧原蟲DNA文厙的構(gòu)建及克隆篩選
    實驗材料
    實驗方法
        (一) 間日瘧原蟲的采集與分離
        (二) 間日瘧原蟲基因組DNA的提取
        (三) 質(zhì)粒DNA的提取
        (四) 質(zhì)粒DNA的純化
        (五) DNA瓊脂糖凝膠電泳
        (六) 間日瘧原蟲基因組DNA的部分酶切
        (七) 質(zhì)粒DNA的酶切與制備
        (八) DNA酶切片段的回收
        (九) 質(zhì)粒線性載體的去磷酸化
        (十) 感受態(tài)細胞的制備
        (十一) DNA的連接和轉(zhuǎn)化
        (十二) ³²P-DNA探針的制備
        (十三) 菌落原位雜交
    實驗結(jié)果
        (一) 間日瘧原蟲的分離及其DNA提取
        (二) 質(zhì)粒DNA的提取和酶切
        (三) 間日瘧原蟲基因組DNA的部分酶切和克隆
        (四) 間日瘧原蟲DNA克隆的篩選
    討論
第二部分 間日瘧原蟲DNA克隆的鑒定與分析
    材料和方法
        (一) 實驗材料
        (二) 細菌培養(yǎng)
        (三) 質(zhì)粒DNA的提取和酶切鑒定
        (四) M₁₃噬菌體雙鏈DNA的制備
        (五) M₁₃噬菌體的重組與鑒定
        (六) M₁₃噬菌體單鏈DNA的制備
        (七) Southern blot分析
        (八) DNA序列測定
        (九) DNA序列數(shù)據(jù)的微機處理
    實驗結(jié)果
        (一) 間日瘧原蟲DNA重組質(zhì)粒的酶切鑒定
        (二) Southern blol分析
        (三) DNA序列分析
    討論
第三部分 用重組DNA探針檢測間日瘧原蟲
    材料和方法
        (一) 實驗材料
        (二) 常規(guī)基因工程操作技術
        (三) ³²p標記探針的打點雜交
        (四) 生物素標記探針的制備
        (五) 生物素標記探針的打點雜交
    實驗結(jié)果
        (一) ³²P標記探針診斷間日瘧的反應性
            1、雜交敏感性
            2、雜交特異性
            3、與鏡檢符合率
        (二) 生物素標記探針檢測間日瘧原蟲的反應性
            1、顯色靈敏度
            2、雜交敏感性
            3、雜交特異性
    討論
總結(jié)
致謝
參考文獻



本文編號：4012717