本文關(guān)鍵詞：畢赤酵母中人RANK胞外段的表達(dá)純化及其阻斷作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：NF-κB的受體活化因子配體/受體(RANKL/RANK)信號(hào)介導(dǎo)破骨細(xì)胞形成和骨吸收。此外,此信號(hào)還可以影響其他生物學(xué)過(guò)程,包括免疫系統(tǒng)和癌癥。RANKL/RANK信號(hào)在淋巴結(jié)發(fā)育、淋巴細(xì)胞分化、樹(shù)突狀細(xì)胞存活、T細(xì)胞活化和免疫耐受誘導(dǎo)中均扮演著重要角色。因此,抑制RANKL為阻止骨疾病、癌癥病人的骨轉(zhuǎn)移、骨免疫相關(guān)疾病、打破中樞免疫耐受促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答T細(xì)胞的發(fā)生等提供一個(gè)新的思路與治療手段。本研究首先對(duì)人RANK胞外段序列進(jìn)行畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的密碼子優(yōu)化,然后克隆到pPIC9K酵母表達(dá)載體中,將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母,篩選獲得高表達(dá)RANK胞外段蛋白(RANK-N)的菌株。我們通過(guò)SDS-PAGE、考馬斯亮藍(lán)染色和Western Blot鑒定,證實(shí)所構(gòu)建表達(dá)菌株及目的蛋白的正確性。經(jīng)過(guò)搖瓶表達(dá)的超濾、Sephadex G-50凝膠過(guò)濾層析和Q Sepharose FF離子交換層析三個(gè)步驟純化重組蛋白,獲得了純度在95%以上的目的蛋白。利用等離子共振(SPR)技術(shù)分析重組RANK蛋白與RANKL蛋白之間的親和力,進(jìn)而證實(shí)了重組RANK-N能結(jié)合RANKL。通過(guò)一系列體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組RANK-N蛋白能夠阻斷RANKL激活的RANK信號(hào)。此外,我們利用人結(jié)直腸癌小鼠移植瘤模型(patient derived xenograft,PDX)發(fā)現(xiàn)RANK胞外段蛋白可以抑制人結(jié)腸癌的生長(zhǎng)。通過(guò)此項(xiàng)研究,我們建立了一個(gè)簡(jiǎn)單有效、可線性放大的RANK-N表達(dá)純化系統(tǒng),為最終的大規(guī)模生產(chǎn)及成果轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：RANK 畢赤酵母 蛋白純化 骨疾病 結(jié)腸癌
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78;R363
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 縮略詞索引7-8
• 1.引言8-19
• 1.1 RANK8-10
• 1.2 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)10-11
• 1.3 RANK/RANK/OPG簡(jiǎn)介11-18
• 1.4 研究目的18-19
• 2.材料和方法19-40
• 2.1 材料19-25
• 2.2 方法25-40
• 3.結(jié)果40-50
• 3.1 克隆RANK胞外端基因40-41
• 3.2 篩選獲得畢赤酵母較高表達(dá)菌株41-42
• 3.3 RANK-N表達(dá)菌株蛋白搖瓶表達(dá)、純化和糖基化鑒定42-46
• 3.4 RANK-N的體外功能46-49
• 3.5 RANK-N的體內(nèi)功能49-50
• 4.討論和結(jié)論50-54
• 參考文獻(xiàn)54-62
• 致謝62-64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄64-65
• 綜述65-73
• 參考文獻(xiàn)70-73

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：386724