發(fā)布時間：2017-05-22 14:25

  本文關(guān)鍵詞：鳥分枝桿菌耐受活性氮和活性氧基因的篩選及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：鳥分枝桿菌是細胞內(nèi)寄生菌,在艾滋病晚期�？砂l(fā)生鳥分枝桿菌的擴散性感染。巨噬細胞作為分枝桿菌的宿主細胞,其內(nèi)微環(huán)境包含有多種殺(抑)菌機制,比如酸、活性氧(ROS,如02、H2O2)和活性氮(RNS,如NO、NO2)、多種溶菌酶、抗菌肽等。這些機制的存在,理論上可以有效的抑制進入巨噬細胞的病原細菌。但是,某些病原細菌在感染早期顯然能夠耐受這些殺(抑)菌機制,在巨噬細胞內(nèi)大量繁殖,為后續(xù)全身性的胞外感染奠定基礎(chǔ)。本文通過構(gòu)建鳥分枝桿菌基因組文庫,篩選耐受活性氮和活性氧相關(guān)基因,以探討鳥分枝桿菌適應(yīng)巨噬細胞的殺(抑)菌機制,為深入研究鳥分枝桿菌的致病機理給出新的線索,進而為新藥物的開發(fā)提供可能的靶點。方法： (1)利用CTAB法提取鳥分枝桿菌基因組DNA,用Sau3A Ⅰ部分酶切后與用BamH Ⅰ酶切并經(jīng)磷酸化處理的pUC19質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,構(gòu)建鳥分枝桿菌基因組文庫；(2)利用生物活性水平篩選方法,通過含有NaNO2的培養(yǎng)液,從鳥分枝桿菌基因組文庫中篩選耐受活性氮的克隆子；(3)對所得的克隆子進行測序以獲取插入片段的序列,通過生物信息學分析獲取插入序列的信息和目的基因；(4)根據(jù)目的基因的開放閱讀框架設(shè)計引物,利用PCR擴增目的基因,與相應(yīng)的表達載體連接后構(gòu)建重組表達質(zhì)粒；(5)重組表達質(zhì)粒在大腸桿菌誘導表達及表達產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測；(6)分別以NaNO2、GSNO、H2O2、SDS作為脅迫,通過計算平板菌落數(shù)(CFU)或測定吸光度值,分析重組目的基因的耐受性。(7)利用生物信息學對目的基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)和功能位點進行預(yù)測分析。結(jié)果：構(gòu)建的鳥分枝桿菌基因組文庫滴度為8×103cfu/ml,隨機挑選10個克隆進行BamH I酶切分析,可見插入片段大小約在100-750bp之間,基本達到文庫建立的要求。通過含有NaNO2的培養(yǎng)液,從構(gòu)建的鳥分枝桿菌基因組文庫中篩選到一個耐受活性氮的克隆子,測序結(jié)果分析表明,該克隆子的插入序列有兩個讀碼框,一個編碼目的基因(取名為noA),另一個編碼P49蛋白基因,分別處在插入序列的兩條鏈上。構(gòu)建noA重組表達質(zhì)粒做NaNO2、GSNO、H2O2、SDS脅迫試驗,結(jié)果顯示noA耐受NaNO2、 GSNO2、H2O2的能力明顯高于對照,而其耐受SDS的能力與對照沒有顯著性差異。結(jié)論：從鳥分枝桿菌基因組文庫中篩選到一個能抵抗NaNO2、 H2O2脅迫的基因-noA,這是一個新型的耐受活性氧和活性氮基因。從預(yù)測的理化性質(zhì)、功能位點及結(jié)構(gòu)特點推斷,noA蛋白有可能成為診斷、治療或者預(yù)防鳥分枝桿菌病的有價值的靶分子。
【關(guān)鍵詞】：鳥分枝桿菌 基因組文庫 耐受 ROS RNS noA
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378
【目錄】：

• 個人簡歷3-7
• 英文縮略語表7-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-16
• 第一章 鳥分枝桿菌基因組文庫的構(gòu)建16-26
• 1 材料與儀器16-17
• 1.1 實驗材料16
• 1.2 主要儀器設(shè)備16
• 1.3 主要試劑配置16-17
• 2 實驗方法17-21
• 2.1 JM109感受態(tài)細胞的制備(CaCl_2法)17-18
• 2.2 感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化率檢測18
• 2.3 鳥分枝桿菌基因組DNA制備(CTAB抽提法)18-19
• 2.4 pUC19質(zhì)粒去磷酸化處理19-20
• 2.5 基因組DNA部分酶切20
• 2.6 連接與轉(zhuǎn)化20-21
• 2.7 文庫鑒定21
• 3 實驗結(jié)果21-23
• 3.1 E.coli JM109感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化率檢測21
• 3.2 基因組DNA提取結(jié)果21
• 3.3 pUC19質(zhì)粒去磷酸化處理和基因組部分酶切21-23
• 3.4 文庫構(gòu)建及質(zhì)量檢測23
• 4 分析與討論23-26
• 第二章 耐受活性氮基因的篩選26-32
• 1 材料與儀器26
• 1.1 實驗材料26
• 1.2 主要儀器設(shè)備26
• 1.3 主要試劑配制26
• 2 實驗方法26-27
• 2.1 文庫的篩選26-27
• 2.2 測序及序列初步分析[33]27
• 3 實驗結(jié)果27-30
• 3.1 基因組文庫的篩選及目的克隆的獲得27
• 3.2 序列分析結(jié)果27-30
• 4 分析與討論30-32
• 第三章 MAC-noA耐受活性氮和活性氧的功能研究32-45
• 1 材料與儀器32-33
• 1.1 實驗材料32
• 1.2 主要儀器設(shè)備32
• 1.3 主要試劑配制32-33
• 2 實驗方法33-37
• 2.1 MAC-noA引物設(shè)計及擴增33-34
• 2.2 pUC19-noA重組載體構(gòu)建34
• 2.3 pGEX-noA和pET-noA重組表達載體的構(gòu)建34
• 2.4 原核表達及檢測34-36
• 2.5 MAC-noA耐受活性氮和活性氧的功能研究36-37
• 3 實驗結(jié)果37-42
• 3.1 PCR擴增和重組載體構(gòu)建37
• 3.2 耐受活性氮和活性氧的功能研究結(jié)果37-42
• 4 分析與討論42-45
• 第四章 MAC-noA編碼蛋白生物信息學分析45-52
• 1 分析方法45
• 2 結(jié)果與分析討論45-52
• 2.1 理化性質(zhì)分析45-48
• 2.2 二級結(jié)構(gòu)分析48
• 2.3 功能位點分析48
• 2.4 同源性分析與進化樹的建立48-51
• 2.5 同源建模51-52
• 總結(jié)52-54
• 參考文獻54-59
• 綜述59-77
• 參考文獻70-77
• 附件77-78
• 致謝78-79
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄79

【參考文獻】

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1 陳q，

本文編號：385982