本文關鍵詞：CaV1.1-R528H突變小鼠甲亢性低鉀型周期性麻痹模型的建立及其機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的低鉀型周期性麻痹(hypokalemic periodic paralysis,簡稱HPP)主要分為散發(fā)型低鉀型周期性麻痹(sporadical hypokalemic periodic paralysis,SHPP)、家族性低鉀型周期性麻痹(familial hypokalemic periodic paralysis,簡稱FHPP)和甲亢性低鉀型周期性麻痹(thyrotoxic hypokalemic periodic paralysis,簡稱TPP)。家族性低鉀型周期性麻痹是一種與骨骼肌電壓門控L-型鈣通道和鈉通道異常有關的常染色體顯性遺傳病,主要涉及的突變基因有CACNA1S、SCN4A和KCNE3,其中CACNA1S基因突變是最常見的。在甲亢性低鉀型周期性麻痹中,也發(fā)現(xiàn)了相關離子通道基因的突變,如KCNE3、KCNE4基因以及Kir2.6的突變,但除個別報道外,數(shù)量極少,陽性率不足1%,但也說明TPP是有離子通道疾病的特點。因此,已發(fā)現(xiàn)的低鉀型周期性麻痹相關突變可以作為甲亢性低鉀型周期性麻痹發(fā)病機制研究的借鑒與補充。目前對于離子通道的突變?nèi)绾螌е翲PP或TPP的發(fā)病,還不是十分清楚,國內(nèi)外對HPP的相關研究也僅局限于細胞水平及離子通道的電生理改變。前期課題組選擇代表性好、發(fā)病癥狀重的Ca V1.1-Arg528His(R528H)突變,運用同源重組和胚胎干細胞技術成功的構建了Ca V1.1-R528H突變小鼠模型。然而在我國,低鉀型周期性麻痹主要以甲亢性低鉀型周期性麻痹為主。為了方便研究TPP發(fā)病機制,我們利用課題組前期構建的鈣離子通道缺陷型Ca V1.1-R528H突變小鼠進一步建立甲亢性低鉀型周期性麻痹模型并對其相關機制進行研究,期望能從整體動物水平探索相關發(fā)病機制,為臨床提供更好的診療依據(jù)。方法部分1 Ca V1.1-R528H突變小鼠鑒定:實驗前隨機抽取8只Ca V1.1-R528H突變小鼠,提取鼠尾基因組DNA進行PCR鑒定,并在8只小鼠基因組DNA的PCR產(chǎn)物中隨機選取5只進行DNA測序。部分2 Ca V1.1-R528H突變小鼠與野生型C57BL/6J小鼠生化指標比較:實驗前取8周齡Ca V1.1-R528H突變小鼠雌雄各8只以及8周齡野生型C57BL/6J小鼠雌雄各8只。所有小鼠于當日20:00開始禁食、禁水,次日早晨8:00摘取眼球取血于EP管中送檢,檢測生化指標包括葡萄糖(GLU)、丙氨酸氨基轉氨酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、血肌酐(Cr)、電解質(zhì)(Na~+、K~+、Cl-)8項指標。部分3探討突變、甲狀腺素及胰島素因素對血鉀的作用:取8周齡Ca V1.1-R528H突變雄性小鼠及8周齡野生型C57BL/6J雄性小鼠各36只,采用三因素兩水平2×2×2析因設計方法,按體重隨機原則分為8組,甲狀腺素處理組每日腹腔注射左旋甲狀腺素鈉(按350μg/kg),連續(xù)給藥12天,制備高甲狀腺素毒癥,同時其余組給予注射0.9%生理鹽水作為對照。末次給藥后胰島素處理組給予腹腔注射短效胰島素(按0.8U/kg),同時其余組給予0.9%生理鹽水作為對照,檢測并記錄注射前(0min)及注射后各時間點(30mim、60min)的血鉀。部分4 FXYD1蛋白在甲亢性低鉀型周期性麻痹致病中的作用:小鼠(野生+鹽水組、突變+鹽水組、突變+甲狀腺素+鹽水組、突變+甲狀腺素+胰島素組)測完血鉀后將其處死,立即取后肢股四頭肌,大小約1cm×0.5cm×0.2cm,并快速放入10%中性福爾馬林溶液中固定,固定24h后石蠟包埋。4μm連續(xù)切片,于65℃溫箱烘干,常溫保存?zhèn)溆�。采用免疫組織化學技術對各組小鼠骨骼肌細胞FXYD1蛋白進行染色,并比較組間表達是否存在差異。結果部分1 Ca V1.1-R528H突變小鼠鑒定:PCR和DNA測序結果驗證了該小鼠為Ca V1.1-R528H突變純合小鼠,DNA擴增片段長度為870bp,而野生對照組為748bp。部分2 CaV1.1-R528H突變小鼠與野生型C57BL/6J小鼠生化指標比較:基因敲入Ca V1.1-R528H突變小鼠與野生型C57BL/6J小鼠同性別之間比較,結果無統(tǒng)計學差異(P0.05);基因敲入Ca V1.1-R528H小鼠雌、雄之間比較及野生型C57BL/6J小鼠雌、雄之間比較,結果均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。部分3突變、甲狀腺素及胰島素因素對血鉀的作用:(1)高甲狀腺素毒癥狀態(tài):甲狀腺素處理組小鼠出現(xiàn)煩躁不安、易激怒及毛色枯燥等現(xiàn)象,相比對照組飲食及飲水量明顯增多,而體重增加緩慢。T3、T4及TSH檢測結果示Ca V1.1-R528H突變小鼠與C57BL/6J小鼠之間并無統(tǒng)計學上差異,而注射左旋甲狀腺素鈉組小鼠T3、T4均高于相應對照組,TSH低于相應對照組,且均有統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)胰島素對血鉀作用:單獨給予甲狀腺素或胰島素處理,突變組與野生組血鉀同時間點比較并沒有統(tǒng)計學差異,而在高甲狀腺素毒癥狀態(tài)下給予胰島素處理后,突變組與野生組同時間點(30min、60min)比較突變組血鉀顯著低于野生組(P0.05)。(3)單獨突變因素或甲狀腺素因素對血鉀并沒有作用,僅有胰島素對降低血鉀有作用(P0.05);甲狀腺素因素和突變因素之間以及胰島素因素和突變因素之間均有交互作用(P0.05);甲狀腺素因素和胰島素因素之間沒有交互作用。部分4 FXYD1蛋白在甲亢性低鉀型周期性麻痹致病中的作用:統(tǒng)計結果顯示FXYD1蛋白表達水平在野生+鹽水組與突變+鹽水組二者之間并沒有差異;突變+甲狀腺素+鹽水組、突變+甲狀腺素+胰島素組與突變+鹽水組相比FXYD1蛋白表達均無統(tǒng)計學上差異(P0.05)。結論1.通過對Ca V1.1-R528H突變小鼠的鑒定,證實該突變基因在傳代中不會發(fā)生丟失;2.本研究利用Ca V1.1-R528H突變小鼠首次成功的建立了甲亢性低鉀型周期性麻痹模型;3.在甲亢性低鉀型周期性麻痹中Na~+,K~+-ATP酶FXYD1亞基蛋白表達水平并沒有發(fā)生改變。
【關鍵詞】：甲亢性低鉀型周期性麻痹 基因敲入 高甲狀腺素 胰島素 FXYD1
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R746.3;R-332
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 1 前言16-21
• 2 材料與方法21-26
• 2.1 材料21-22
• 2.2 實驗方法22-25
• 2.3 統(tǒng)計學方法25-26
• 3 結果26-32
• 3.1 Ca V1.1-R528H 突變小鼠鑒定結果26
• 3.2 Ca V1.1-R528H 突變小鼠與野生型 C57BL/6J 小鼠生化指標比較結果26-27
• 3.3 突變、甲狀腺素及胰島素因素對血鉀的作用27-30
• 3.4 FXYD1蛋白在甲亢性低鉀型周期性麻痹致病中的作用30-32
• 4 討論32-37
• 5 結論37-38
• 參考文獻38-41
• 附錄 個人簡介41-42
• 致謝42-43
• 綜述 胰島素促進低鉀型周期性麻痹機制的研究進展43-51
• 參考文獻50-51

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 智紅葉;CaV1.1-R528H突變小鼠甲亢性低鉀型周期性麻痹模型的建立及其機制的研究[D];安徽醫(yī)科大學;2016年

  本文關鍵詞：CaV1.1-R528H突變小鼠甲亢性低鉀型周期性麻痹模型的建立及其機制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：387157