早在1897年Ronald Ross就發(fā)現(xiàn)瘧疾是蚊媒傳播的疾病，100余年后的今天，瘧疾仍然是人類健康的主要威脅之一。對各種瘧原蟲基因及其基因產(chǎn)物的功能研究是發(fā)現(xiàn)有效疫苗候選抗原和抗瘧藥物作用靶位的必要前提。基因敲除可為蛋白功能提供重要的信息，但其所反映的信息只是全有或全無的。對瘧原蟲有重要功能的蛋白基因不能通過基因敲除來研究，否則會導(dǎo)致瘧原蟲的死亡而無法研究，如MSP1和AMA-1。因此，需要建立一種可誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)基因表達系統(tǒng)，以有效控制基因的表達。 目前認(rèn)為四環(huán)素誘導(dǎo)表達系統(tǒng)是最有前途的誘導(dǎo)性系統(tǒng)。GBP130是主要于滋養(yǎng)體期轉(zhuǎn)錄的期特異性基因，該基因啟動子含有單一的轉(zhuǎn)錄起始點，有利于在其附近插入四環(huán)素識別調(diào)控元件。對GBP130的5’側(cè)翼序列進行分析，發(fā)現(xiàn)具有高轉(zhuǎn)錄活性的最小調(diào)控序列，以及可能的期特異性和非期特異性調(diào)控元件，進而還可以建立期特異性和非期特異性誘導(dǎo)表達系統(tǒng)。已有研究認(rèn)為GBP130的5’側(cè)翼序列的轉(zhuǎn)錄起始點上游不存在期特異性調(diào)控元件，但轉(zhuǎn)錄起始點下游是否具有期特異性調(diào)控功能還不清楚。 本研究建立了一種有效的瘧原蟲瞬時基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將GBP130基因5’近端側(cè)... 

【文章來源】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)陜西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
目 錄
英文縮寫詞注
中文摘要
前 言
文獻回顧
    1 瘧原蟲基因轉(zhuǎn)染的研究進展
        1.1 瘧原蟲基因轉(zhuǎn)染的種類
            1.1.1 瞬時轉(zhuǎn)染
            1.1.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
                1.1.2.1 附加體型的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
                1.1.2.2 整合型的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
        1.2 轉(zhuǎn)染蟲體中質(zhì)粒載體的分子生物學(xué)特征
        1.3 瘧原蟲基因傳染的方法學(xué)
            1.3.1 瘧原蟲轉(zhuǎn)染載體的主要構(gòu)件
                1.3.1.1 調(diào)控序列
                1.3.1.2 報告基因
                1.3.1.3 篩選標(biāo)記
            1.3.2 轉(zhuǎn)染方法
            1.3.3 轉(zhuǎn)染效率
            1.3.4 轉(zhuǎn)染子的鑒定
        1.4 瘧原蟲基因轉(zhuǎn)染的應(yīng)用
            1.4.1 基因表達調(diào)控
            1.4.2 基因功能研究
            1.4.3 藥物研究
            1.4.4 疫苗研究
            1.4.5 細(xì)胞生物學(xué)
        1.5 結(jié) 語
    2 瘧原蟲基因表達調(diào)控研究現(xiàn)狀
        2.1 瘧原蟲基本的分子生物學(xué)
            2.1.1 瘧原蟲的進化
            2.1.2 基因組
                2.1.2.1 基因組大小
                2.1.2.2 堿基組成
        2.2 瘧原蟲基因表達調(diào)控的策略
            2.2.1 發(fā)育性調(diào)控
            2.2.2 多級水平協(xié)同調(diào)控
            2.2.3 轉(zhuǎn)錄前調(diào)控
                2.2.3.1 染色體大小的變化
                2.3.3.2 組蛋白乙�；�
                2.2.3.3 染色體構(gòu)象與轉(zhuǎn)錄
                2.2.3.4 染色體的結(jié)構(gòu)
            2.2.4 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控
                2.2.4.1 RNA聚合酶
                2.2.4.2 轉(zhuǎn)錄起始位點
                2.2.4.3 順式作用元件
                2.2.4.4 反式作用因子
                2.2.4.5 順式作用元件與反式作用因子的相互作用
            2.2.5 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控
                2.2.5.1 5’非翻譯區(qū)
                2.2.5.2 RNA剪接
                2.2.5.3 3’非翻譯區(qū)
            2.2.6 翻譯水平的調(diào)控
            2.2.7 翻譯后水平的調(diào)控
研究內(nèi)容
第一部分 惡性瘧原蟲瞬時基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的建立
    1 材料與方法
        1.1 材 料
            1.1.1 培養(yǎng)原蟲
            1.1.2 菌株
            1.1.3 載體
            1.1.4.3 商品化試劑盒
            1.1.4.4 試劑
            1.1.5 儀器
        1.2 方法
            1.2.1 紅內(nèi)期瘧原蟲體外連續(xù)培養(yǎng)
            1.2.2 瘧原蟲同步化處理
            1.2.3 質(zhì)粒的大量提取和純化
            1.2.4 P．f瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的建立
                1.2.4.1 紅內(nèi)期瘧原蟲的轉(zhuǎn)染
                1.2.4.2 轉(zhuǎn)染蟲體細(xì)胞抽提物的制備
                1.2.4.3 CAT活性的檢測
    2 結(jié) 果
第二部分 GBP130基因5’近端側(cè)翼序列基因表達調(diào)控的初步研究
    1 材料與方法
        1.1 材 料
            1.1.1 培養(yǎng)原蟲、菌株及載體
            1.1.2 試劑及儀器
            1.1.3 序列及引物
        1.2 方法
            1.2.1 紅內(nèi)期瘧原蟲體外連續(xù)培養(yǎng)、同步化處理及質(zhì)粒的大量提取和純化
            1.2.2 pGBPΔ2/615的構(gòu)建
                1.2.2.1 目的片段（F_（615））的PCR擴增和純化
                1.2.2.2 重組質(zhì)粒pUC/615的構(gòu)建及測序分析
                1.2.2.3 重組質(zhì)粒pGBPΔ2/615的構(gòu)建
            1.2.3 瘧原蟲轉(zhuǎn)染分析
    2 結(jié) 果
        2.1 pGBPΔ2/615的構(gòu)建
            2.1.1 F_（615）目的片段的PCR擴增和純化
            2.1.2 重組質(zhì)粒pUC/615的構(gòu)建及測序分析
            2.1.3 重組質(zhì)粒pGBPΔ2/615的構(gòu)建
        2.2 GBP1305’近端側(cè)翼序列調(diào)控功能的初步分析
第三部分 GBP130基因5’近端側(cè)翼序列強度和期特異性調(diào)控的研究
    1 材料與方法
        1.1 材 料
        1.2 方法
            1.2.1 紅內(nèi)期瘧原蟲體外連續(xù)培養(yǎng)、同步化處理及質(zhì)粒的大量提取和純化
            1.2.2 pGBPΔ2/400和pGBPΔ2/800的構(gòu)建
                1.2.2.1 目的片段的PCR擴增和純化
                    F_（400）的擴增
                    F_（800）的擴增
                1.2.2.2 pGBPΔ2/400和pGBPΔ2/800的構(gòu)建
                    pGBPΔ2/400的構(gòu)建及篩選
                    pGBPΔ2/800的構(gòu)建及篩選
                1.2.2.3 pUC/400和pUC/800的構(gòu)建及測序分析
            1.2.3 瘧原蟲轉(zhuǎn)染分析
                1.2.3.1 近端序列不同區(qū)域調(diào)控強度的分析
                1.2.3.2 近端序列不同區(qū)域調(diào)控期特異性的分析
    2 結(jié) 果
        2.1 pGBPΔ2/400和pGBPΔ2/800的構(gòu)建
            2.1.1 目的片段的PCR擴增和純化
            2.1.2 pGBPΔ2/400的構(gòu)建及篩選
            2.1.3 pGBPΔ2/800的構(gòu)建及篩選
        2.2 pUC/400和pUC/800的構(gòu)建及測序分析
        2.3 GBP130基因5’近端側(cè)翼序列調(diào)控功能的分析
            2.3.1 強度調(diào)控分析
            2.3.2 期特異性調(diào)控分析
    討論
        1 P．f瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的建立
        2 質(zhì)粒的構(gòu)建
        3 GBP130基因5’近端側(cè)翼序列的調(diào)控
            3.1 強度調(diào)控
            3.2 期特異性調(diào)控
小結(jié)
參考文獻
致謝
附錄： 研究生期間發(fā)表論文及譯文情況


【參考文獻】：
期刊論文
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[2]惡性瘧原蟲紅細(xì)胞膜蛋白 1在瘧原蟲免疫逃避中的作用[J]. 王憲鋒,薛采芳,甄榮芳.  地方病通報. 2000(02)
[3]硫酸軟骨素A介導(dǎo)的惡性瘧原蟲感染的紅細(xì)胞粘附[J]. 高美麗,王憲鋒,楊建雄.  陜西師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2000(01)
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[5]脂質(zhì)體法和電穿孔法轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞研究[J]. 錢鋒,肖成祖.  生物化學(xué)與生物物理進展. 1999(03)
[6]基因靶位操作的原理與策略[J]. 汪亞平,朱作言.  遺傳. 1999(03)
[7]綠色熒光蛋白在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 賀竹梅,李華平,李寶健,李志芳,黃定華.  遺傳. 1998(05)
[8]研究活細(xì)胞生命現(xiàn)象的新途徑──綠色熒光蛋白基因的重組與表達[J]. 田竟生,吳曉菁,潘海燕.  首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 1998(03)
[9]活細(xì)胞的分子探針——綠色熒光蛋白[J]. 何琪楊,張鴻卿,薛紹白.  國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊). 1997(06)



本文編號：3349346