目的觀察ERK5信號通路對MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖,及功能分化蛋白BMP2/BMP7的影響。方法應(yīng)用小RNA分子干擾技術(shù)（siRNA）沉默ERK5基因,分別將濃度為20、40、60、80 nmol/L的ERK5 siRNA干預(yù)MC3T3-E1成骨細(xì)胞,篩選ERK5 siRNA轉(zhuǎn)染的最佳濃度。噻唑藍(lán)實驗（MTT）檢測轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、36 h和48 h細(xì)胞的增殖情況,實時熒光定量PCR檢測ERK5、BMP2和BMP7 mRNA的表達(dá)。Westernblot檢測不同干預(yù)組BMP2及BMP7蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果當(dāng)ERK5siRNA濃度為60 nmol/L時,MC3T3-E1成骨細(xì)胞的ERK5 mRNA的表達(dá)下降最為顯著,沉默率為76.8±2.2%（P<0.01）。ERK5 siRNA轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、36 h,成骨細(xì)胞的增殖受到明顯抑制（P<0.05）,但48 h轉(zhuǎn)染組未發(fā)現(xiàn)明顯變化（P>0.05）。ERK5 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后,實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:空白組與對照siRNA組成骨細(xì)胞的BMP2/BMP7 mRNA變化水平無顯著性差異（P&g... 

【文章來源】：中國骨質(zhì)疏松雜志. 2014,20(09)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

不同濃度siEＲK5對EＲK5mＲNA表達(dá)的影響

24h組0.455±0.0190.449±0.043a0.371±0.061b36h組0.522±0.0230.518±0.029a0.444±0.057b48h組0.634±0.0140.631±0.041a0.608±0.028注:a:與空白組相比，P＞0.05;b:與對照siＲNA組相比，P＜0.05;a:Comparedwithblankgroup，P＞0.05;b:ComparedwithsiＲNAcontrolgroup，P＜0.05．2.3EＲK5siＲNA轉(zhuǎn)染對MC3T3－E1成骨細(xì)胞BMP2、BMP7mＲNA表達(dá)的影響ＲT-PCＲ檢測60nmol/L的siEＲK5轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞24h后，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后成骨細(xì)胞BMP2、BMP7mＲNA水平明顯下降，且統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P＜0.05)(圖2)。圖2siEＲK5轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞BMP2/BMP7mＲNA表達(dá)的影響注:*與空白組和對照組相比有顯著性差異，P＜0.05Fig．2TheeffectofEＲK5siＲNAontheexpressionofBMP2/BMP7mＲNAinosteoblasts(*:comparedwiththeblankgroupandsiＲNAcontrolgroups，P＜0.05)2.4siEＲK5轉(zhuǎn)染對MC3T3-E1成骨細(xì)胞BMP2、BMP7蛋白表達(dá)的影響Westernblot結(jié)果顯示，空白組與對照siＲNA組的BMP2、BMP7沒有顯著性變化，而60nmol/L的siEＲK5轉(zhuǎn)染后，MC3T3-E1成骨細(xì)胞的BMP2、BMP7明顯降低(圖3)。3討論骨形態(tài)發(fā)生蛋白是最為引人注目的一組新型骨生長因子，能夠有效地促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化，其在預(yù)防骨質(zhì)疏松、加快骨折愈合、修補(bǔ)骨缺損等領(lǐng)域中國骨質(zhì)疏松雜志2014年9月第20卷第9期ChinJOsteoporos，September2014，Vol20，No．91057

圖3Westernblot檢測不同干預(yù)組BMP2/BMP7蛋白的表達(dá)Fig．3TheexpressionofBMP2/BMP7proteinindifferenttreatmentgroupsusingWesternblotting中有較為廣泛的應(yīng)用，目前共分離出20余種BMPs。以往研究表明，BMPs主要通過經(jīng)典的Smad信號通路傳遞信號，從而發(fā)揮其生物學(xué)的功能［6］。近年來發(fā)現(xiàn)，BMPs還可以通過MAPKs、PI3K等通路進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此稱之為BMPs的非經(jīng)典信號通路［7］。EＲK5信號通路是MAPKs家族發(fā)現(xiàn)最晚的通路，也是目前研究最少的一條通路。EＲK5磷酸化依次通過MEKK2/3，MKK5級聯(lián)反應(yīng)激活，激活后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，其C端的具有轉(zhuǎn)錄活性的絲氨酸、蘇氨酸與N端的共同作用下激活c-Fos、c-Jun以及AP-1等轉(zhuǎn)化因子，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化。目前研究已證實，EＲK5在內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移以及新血管形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，EＲK5基因缺失的小鼠將死于胚胎早期脈管內(nèi)皮組織系統(tǒng)發(fā)育障礙［3，8］。另外，EＲK5不僅調(diào)節(jié)正常細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，也介導(dǎo)病理細(xì)胞的增殖和凋亡。Kim［9］研究發(fā)現(xiàn)，沉默EＲK5基因后，骨腫瘤的侵襲性以及金屬蛋白酶(MMP9)明顯減少。同時，Kato［10］以及Ｒamsay［11］分別在宮頸癌Hela細(xì)胞以及人前列腺癌PC3細(xì)胞的中，發(fā)現(xiàn)了EＲK5的重要性，并大膽預(yù)測了EＲK5可能是未來治療惡性腫瘤的一個重要的靶點。該結(jié)果同樣也在人成骨肉瘤細(xì)胞MG63中得到證實，程［12］發(fā)現(xiàn)，EＲK5信號通路介導(dǎo)了白介素6對MG63細(xì)胞的增殖分化。然而，EＲK5是否調(diào)節(jié)正常骨細(xì)胞的生理功能目前鮮有報道。siＲNA技術(shù)是利用具有同源性的雙鏈ＲNA誘導(dǎo)沉默序列特異的目的基因，并迅速阻斷該基因的活性，從而觀察該基因?qū)?xì)胞的影響。本研究采用siＲNA干擾技術(shù)，沉默MAＲKs家族中EＲK5基因的表達(dá)，初步?

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]ERK5調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能的研究[J]. 程群,朱漢民,甘潔民,繆應(yīng)新,施泓.  中國骨質(zhì)疏松雜志. 2008(12)



本文編號：3348280