發(fā)布時間：2021-04-02 11:19

　　用異硫氰酸胍抽提抗?jié)h灘病毒單克隆抗體大鼠雜交瘤細胞株KF12的總RNA，用逆轉錄酶合成第一鏈cDNA，用PCR技術擴增出360bp的重鏈變區(qū)基因（V_H）和351bp輕鏈變區(qū)基因（V_L），分別克隆至pUCV_NP-PCR和pWR13載體上，經篩選和DNA序列分析研究，證實已獲得了該單克隆抗體的可變區(qū)基因。 通過一系列重組，將PCR擴增的抗?jié)h灘病毒單抗的重鏈變區(qū)基因（360bp），克隆至能在真核細胞中進行表達的載體中得pTZVHBⅡ，然后再與免疫球蛋白重鏈增強子克隆得pSV-VE質粒，最終和pSVΔHgptHur 3質粒重組，經酶譜分析及Southern blot，挑得一連接方向正確的可表達人—鼠嵌合抗體的嵌合質粒pSVΔHgptRatKF12 VHHur3。通過電脈沖介導基因 

【文章來源】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學陜西省 211工程院校

【文章頁數】：114 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

PCR擴增的可變區(qū)基因電泳分析

與分子量標準比較其DNA片段大小約4。。bp，與推測抗體重因大小相近(見圖1)。用VK一BACK和VK一OFR一對引物從雜交瘤細胞擴增此大鼠單抗輕鏈可變區(qū)基因，擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電可見一條明顯擴增帶，與分子量標準比較，DNA片段分子大小約抗體輕鏈可變區(qū)大小相符，推測為此抗體輕鏈可變區(qū)基因擴增二、大鼠單抗VH、V毛基因的克隆和序列測定正向引物第二次加樣AC、GT第一次加樣ACGT反向引物第二次加樣第一次加樣ACGTACGT

。RI，P。tI雙酶切，5個克隆提取的質粒DNA切出了約400bp大小的片段，隨機選擇3個提取含vL基因片段的pwR，:Ra七KF12vH質粒DNA，進行DNA序列反應，放射自顯影結果(見圖4)，讀片記錄所測Lv基因序列(見圖5)，所得VL序列輸人計算機分析，發(fā)現此基因為一新基因，基因庫中無相同基因。


本文編號：3115180