背景:端粒酶反轉錄酶是一種重要的調控細胞分化增殖的酶,其具有多種生物活性。研究表明,經過h TERT基因修飾后可能有利于提高甲狀旁腺細胞增殖能力的存活能力和功能,能夠起到對甲狀旁腺細胞體外培養(yǎng)的優(yōu)化作用。目的:用負載h TERT目的基因的反轉錄病毒PLXSN轉染大鼠甲狀旁腺細胞,觀察細胞生物學特性及細胞分泌功能變化,以探討甲狀旁腺細胞培養(yǎng)更為優(yōu)化的方法。方法:28只雄性Wistar大鼠,由北京維通利華動物實驗技術有限公司提供,經天津醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會批準（批準號為2017-0652）。大鼠麻醉后切取甲狀旁腺并通過病理學確認,用膠原酶Ⅱ消化獲得甲狀旁腺細胞,并經過Westernblot檢測鈣敏感性受體、甲狀旁腺激素和神經膠質細胞缺失轉錄因子（GCM-2）進行鑒定。將鑒定后細胞分為正常的甲狀旁腺細胞組、空病毒組和h TERT轉染組。h TERT轉染后3d,通過RT-PCR和Western blot檢測各組細胞中h TERT基因和蛋白相對表達;應用細胞生長曲線和CCK-8法觀察細胞生長情況;采用流式細胞術測定細胞周期分布;使用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測細胞的上清液中甲狀旁腺激素的濃度變化... 

【文章來源】：中國組織工程研究. 2019,23(25)北大核心

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【部分圖文】：

甲狀旁腺細胞標志分子表達水平Figure2Levelsofsurfacemarkersofparathyroidcellsβ-actin

赴??で?嘸跋赴?鮒郴钚?與正常的甲狀旁腺細胞和含有空載病毒的細胞相比，hTERT基因轉染顯著提高了甲狀旁腺細胞的增殖活性，差異有顯著性意義(P<0.05)，見表3。實驗采用CCK-8法繪制了甲狀旁腺細胞的生長曲線。hTERT基因轉染組中甲狀旁腺細胞的增殖活性在培養(yǎng)72h后顯著快于正常對照組和空載病毒組中的細胞增殖速度，差異有顯著性意義(P<0.05)，見圖5。圖注：圖A為細胞培養(yǎng)當天；B為細胞培養(yǎng)2d；C為細胞培養(yǎng)3d。經過鑒定所培養(yǎng)細胞為甲狀旁腺細胞的主細胞。圖1大鼠甲狀旁腺細胞的形態(tài)特點(×40)Figure1Morphologyofratparathyroidcells(×40)表1甲狀旁腺細胞特異性標記物不同時間表達(x_±s，n=3)Table1Specialmarkersofparathyroidcellsatdifferenttime時間鈣敏感性受體甲狀旁腺激素神經膠質細胞缺失轉錄因子7d0.51±0.070.64±0.050.49±0.0614d1.18±0.12a1.10±0.10a1.23±0.11a21d1.66±0.14ab1.82±0.17ab1.79±0.18ab表注：與7d時比較，aP<0.05；與14d時比較，bP<0.05。7d14d21d鈣敏感性受體甲狀旁腺激素神經膠質細胞缺失轉錄因子β-actin圖2甲狀旁腺細胞標志分子表達水平Figure2Levelsofsurfacemarkersofparathyroidcells圖注：圖A為hTERT基因表達電泳圖；B為hTERT基因相對表達量。與正常對照組及空載病毒組比較，aP<0.05。圖3hTERT基因轉染后細胞中hTERT基因表達Figure3ExpressionofhTERTgeneinthehTERT-transfectedcells表2hTERT基因轉染后細胞中hTERT基因和蛋白表達(x_±s，hTERT/β-actin)Tabl

鼠頸部分離切取甲狀旁腺之后，病理學實驗室診斷確認其為甲狀旁腺；而后的細胞鑒定進一步證明了這一點。鈣敏感性受體、甲狀旁腺激素及神經膠質細胞缺失轉錄因子(GCM2)這3個分子是甲狀旁腺細胞特征性的標志物，Westernblot陽性的檢測結果表明提取的細胞確系甲狀旁腺細胞[18-22]。實驗轉染hTERT后，基因轉染組中細胞中的hTERT的基因和蛋白相對表達水平均顯著升高，由此可知此圖注：圖A為hTERT蛋白表達電泳圖；B為hTERT蛋白相對表達量。與正常對照組及空載病毒組比較，aP<0.05。圖4hTERT基因轉染后細胞中hTERT蛋白表達水平Figure4LevelofhTERTproteininthehTERT-transfectedcells表3甲狀旁腺細胞的增殖活性(x_±s，n=3，A值)Table3Proliferationactivityofparathyroidcells時間正常對照組空載病毒組hTERT基因轉染組24h0.11±0.020.12±0.050.19±0.0348h0.16±0.050.18±0.030.36±0.0472h0.20±0.040.22±0.020.50±0.04a96h0.25±0.060.28±0.030.69±0.05a120h0.29±0.050.32±0.020.80±0.06a表注：與正常對照組及空載病毒組比較，aP<0.05。24h48h72h96h120h1.000.750.500.250aaa正常對照組空載病毒組hTERT基因轉染組A490nm圖注：與正常對照組及空載病毒組比較，aP<0.05。圖5各組細胞生長曲線Figure5Growthcurvesofthecells表4各組細胞周期分布情況(x_±s，n=3，%)Table4Cellcycledistribution周期分布正常對照組空載病毒組hTERT基因轉染組G0/G1期42.13±1.4045.32±1.4925.13±1.55aG2/M期9.81±1.639


本文編號：3107849