皮肌炎／多肌炎是一類自身免疫疾病，嚴重威脅人類健康。抗組氨�！猼RNA合成酶抗體，臨床上又稱抗Jo-1抗體，是診斷這類疾病的標志性抗體。該類疾病診斷的最佳方法是酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA），其靈敏度大大高于免疫雙擴散（DID）和對流免疫電泳，但該方法前提是必須應用高純抗原。生化提取的方法很難得到組分單一的純制品，只能依靠與標準血清或標準圖譜的對照來進行鑒別。利用基因重組技術，制備單一性質的重組Jo-1，可以特異、簡單、快速、準確地鑒別和診斷皮肌炎／多肌炎，有效地提高臨床診斷水平。 本實驗從人胎盤中提取總RNA，利用RT-PCR技術獲得了編碼Jo-1的基因整長序列，選用IMPACT-CN系統(tǒng)中的pTYB11載體，構建了Jo-1基因的克隆與表達載體，并轉化大腸桿菌ER2566，經(jīng)過抗性篩選、分子量大小比較、雙酶切鑒定、和PCR鑒定等多種方法驗證，篩選出了5個陽性克隆。通過誘導表達，獲得了重組的Jo-1融合蛋白，經(jīng)SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分析，產(chǎn)物分子量大小正確。Western blotting免疫檢驗，該融合蛋白能被特異性抗體識別。但表達量不高，而且以包含體的形式存在。 

【文章來源】：河北大學河北省

【文章頁數(shù)】：46 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

pTYBll表達載體物理圖譜

2準斗1盡5圖2總RNA無降解(見圖2)，可用于RT一PCR擴一增。23000!飛們介〔!人胎盤總RNA電泳圖F19.2IsolationoftotalRNAfromhumanPlaeenta3.1.3RT一PCR擴增人Jo一1基因片段以提取的總RNA為模板，用0119(dT)做反向引物，反轉錄第一條鏈。為了獲得目的片段，采用了嵌套引物，即首先以反轉錄產(chǎn)物為模板，用第一對引物primerl、11進行PCR擴增，產(chǎn)物長度為16O8bp，2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，擴增產(chǎn)物單一，分子大小準確，結果見圖3。主60810不》圖3第一對引物RT一PCR擴增產(chǎn)物電泳圖1:RT一PCR產(chǎn)物:M:標準分子量(DL一2000)F19.3RT一PCRamPlifieationofJo一lgeneusingfirstPairofPrimers1:RT一PCRp

圖4Jo一1基因二次擴增結果1基因片段，長1585bp;4:為第一次擴增.4PCRamPlifieationofJo一dPCR，1585BP;4:Produeto建腸桿菌表達系統(tǒng)載體的選統(tǒng)表達N端為1ntein的融合基酸為丙氨酸(Ala)時，使洗脫，目的蛋白的純化效率最一個氨基酸為丙氨酸，為了使，


本文編號：2961847