本文關(guān)鍵詞：單核細胞增生李斯特菌XYSN和NTSN全基因組測序及比較基因組學分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)為兼性胞內(nèi)寄生的革蘭陽性菌,能夠感染人類并引發(fā)胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)等臨床癥狀,死亡率高達20%-30%,同時也能感染40多種動物,其中反芻動物為易感宿主,感染后死亡率為20%-100%,因此,LM是一種重要的食源性人獸共患病原菌。食品污染導致的李斯特菌病暴發(fā)疫情在歐美國家時有發(fā)生,在美國是引發(fā)食物中毒致死的第三大“元兇”。然而,對這些引起李斯特菌病暴發(fā)或散發(fā)菌株的內(nèi)在聯(lián)系及差異本質(zhì)認識不足或知之甚少,而不斷發(fā)展的全基因組測序技術(shù)能夠更全面、精細地分析基因組的堿基序列,對于解讀其所包含的遺傳信息和揭示LM的致病機制提供了強有力的技術(shù)支持。在后基因組時代,可以通過比較基因組學分析的方法來詮釋這些生物學特征的遺傳信息。因此,本研究分別對我國兩株高毒力羊臨床LM分離株XYSN與NTSN進行了全基因組測序和注釋分析,并利用生物信息學軟件進行比較基因組學分析,從而對基因組的遺傳結(jié)構(gòu)、毒力相關(guān)因子和系統(tǒng)發(fā)育進化有了更為全面深入的理解。在此基礎之上,通過同源重組技術(shù)對XYSN中的基因組島9(genomic island 9,G19)進行敲除,并探究其與XYSN高致病力之間的聯(lián)系。這些研究結(jié)果為LM的致病機制及李斯特菌病的預防和控制提供了更可靠的科學依據(jù)和理論基礎。1.動物源分離株XYSN和NTSN的生物學特性研究對動物源分離株XYSN和NTSN進行了生物學特性的相關(guān)研究。傳統(tǒng)生化反應管結(jié)果顯示XYSN不確定,而全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)結(jié)果為單核細胞增生李斯特菌,而NTSN生化鑒定結(jié)果均為單核細胞增生李斯特菌。借助多重PCR及LM診斷血清對分離株的血清型進行鑒定結(jié)果顯示,XYSN血清型尚不明確(4b或4e),而NTSN血清型為4b。藥敏實驗結(jié)果提示,XYSN和NTSN對多種抗生素均表現(xiàn)敏感。對Caco-2細胞侵襲試驗結(jié)果表明,XYSN和NTSN侵襲Caco-2細胞的侵襲率分別為11.5%和6.35%,分別比國際標準株EGD-e(侵襲率為1.53%)高8倍和4倍,表明其具有較高的侵襲力。對BALB/c小鼠的LDso實驗測定中,XYSN的LD50為103.10CFU,毒力比強毒株EGD-e強400倍,為迄今為止發(fā)現(xiàn)毒力最強的LM分離株,而NTSN的LD50為1055.46CFU,毒力與EGD-e相當,屬于強毒菌株。此外,基于管家基因的MLST分型結(jié)果顯示,XYSN和NTSN的ST型分別為626和1,其中STl屬于克隆復合群(Clonal Complex, CC) CC1,而ST626為新申請的ST型。而基于毒力基因actA的遺傳譜系進化分析結(jié)果表明,XYSN位于譜系Ⅰ和Ⅱ之間,但與譜系Ⅱ的菌株親緣關(guān)系更近一些,表明其進化過程的特殊性。而NTSN為典型譜系Ⅰ菌株,其與造成人李斯特菌病暴發(fā)的菌株(F2365、LL195、J1816和Clip80459)處于同一進化位置,暗示其可能屬于高侵襲性流行克隆。2.單核細胞增生李斯特菌XYSN和NTSN的全基因組測定及注釋分析單核細胞增生李斯特菌XYSN是迄今發(fā)現(xiàn)的毒力最高的山羊臨床分離株。通過Roche454和Sanger法測序技術(shù),完成了XYSN的全基因組測序和補缺口(Gap closing)工作。全基因組注釋分析結(jié)果顯示,XYSN基因組全長2,994,702 bp, GC含量為37.95%,編碼2933個蛋白預測基因,編碼區(qū)占整個基因組的88.3%,蛋白平均長度為300個氨基酸,含有67個tRNA以及18個rRNA (16S、23S和5S rRNA各6個)。在基因組和基因注釋的基礎上,運用生物信息學軟件和數(shù)據(jù)庫預測分析出1個CPRISPR、9個基因組島、5個前噬菌體、14對雙組份調(diào)控元件以及一個單獨的調(diào)節(jié)蛋白、Ⅰ型和Ⅱ型限制修飾系統(tǒng)中相關(guān)基因以及19個內(nèi)化素。與其他LM菌株相比,XYSN的內(nèi)化素數(shù)量差異較大,存在inlD、 inlK、inlE、inlF和inlI等內(nèi)化素基因缺失,也存在5個特異的內(nèi)化素基因,其中i-inlF、 i-inlE和LMxysn_2611均來自伊氏李斯特菌,i-inlF和i-inlE存在于基因組島9中,而LMxysn_2611存在于前噬菌體5中。單核細胞增生李斯特菌NTSN是具有強毒力和潛在暴發(fā)流行特點的綿羊臨床分離株。與XYSN采用的測序方法一樣,我們完成了NTSN全基因組序列的測定。全基因組注釋分析結(jié)果顯示,NTSN基因組全長2,904,500 bp, GC含量為38.0%,編碼2821個蛋白預測基因,編碼區(qū)占整個基因組的88.9%,蛋白平均長度為304個氨基酸,含有67個tRNA以及18個rRNA (16S、23S和5S rRNA各6個)。NTSN基因組中含有1個基因組島、1個前噬菌體、14對雙組份調(diào)控元件以及一個單獨的調(diào)節(jié)蛋白、Ⅱ型限制修飾系統(tǒng)中相關(guān)基因和26個內(nèi)化素。其中,NTSN中內(nèi)化素的組成和分布與譜系Ⅰ的4b血清型LM菌株極其相似。3.單核細胞增生李斯特菌XYSN和NTSN比較基因組學分析和進化分析在XYSN比較基因組學分析中,首先選擇國際標準株EGD-e和F2365作為參考菌株,基因組共線性分析顯示XYSN與EGD-e和F2365之間基因組的共線性很好,只有2個共線性模塊(Locally colinear blocks, LCBs)�；蚪M間并未存在翻轉(zhuǎn)、易位等基因組重排現(xiàn)象,但存在缺失或插入,這與氨基酸水平的比對分值比(BLAST score ratio, BSR)分析結(jié)果一致。此外,選取測序菌株XYSN在內(nèi)的15個LM菌株的全基因組,進行LM泛基因組構(gòu)建與分析結(jié)果表明,LM作為一種較保守且穩(wěn)定的物種,具有開放型的泛基因組,能夠容納較低程度的水平基因轉(zhuǎn)移。綜合比較BSR分析和泛基因組分析結(jié)果顯示,XYSN基因組中的特異基因主要為假定蛋白以及一些編碼轉(zhuǎn)座酶和整合酶的基因,其中部分基因存在于5個前噬菌體和9個基因組島中。對XYSN進行潛在毒力基因分析,共挖掘出102個潛在毒力相關(guān)基因,并系統(tǒng)深入地總結(jié)了LM不同功能分類的毒力相關(guān)基因。此外,毒力相關(guān)基因比較分析顯示,XYSN基因組中存在毒力基因缺失、其他屬特有毒力基因獲得以及共有毒力基因突變的現(xiàn)象,暗示這些差異可能與其高致病力相關(guān)。同時,基因突變、缺失和水平基因轉(zhuǎn)移可推動XYSN進化過程。在NTSN比較基因組學分析中,選擇譜系Ⅰ、4b血清型的標準株F2365與LL195作為參考菌株,基因組共線性結(jié)果顯示,NTSN與F2365和LL195之間基因組的共線性極高,僅有1個LCBs,說明基因組序列非常地保守。進一步分析表明,NTSN與F2365高度同源,同源性為99.9%,提示其具有相似的流行特征,但仍含有195個SNPs以及34處插入和缺失,暗示這些因素可能造成生物學特征的微小差異。在進化分析中,基于MVLST分型毒力基因、MLST分型管家基因和基于全基因組中818個核心同源基因的進化分析結(jié)果均顯示,XYSN處于兩大進化分支譜系Ⅰ和Ⅱ之間,但與譜系Ⅱ的菌株親緣關(guān)系較近,表明其進化過程的特殊性。而NTSN屬于典型的譜系Ⅰ菌株,其與造成人李斯特菌病暴發(fā)的菌株(F2365、LL195、J1816和Clip80459)處于同一進化位置,顯示它們是由同一祖先進化而來,且NTSN亦具有引起人李斯特菌病暴發(fā)的潛在可能。4.單核細胞增生李斯特菌XYSN中基因組島9缺失突變株的構(gòu)建、鑒定及生物學特性研究利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了單核細胞增生李斯特菌XYSN中GI9的缺失突變株。利用PCR擴增出XYSN基因組中GI9的上下游同源臂片段之后,采用SOEing PCR方法將上下游同源臂拼接起來,并將拼接片段與pMD20-T載體相連后測序鑒定。測序正確的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切回收后插入載體pAULA中,獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)化導入XYSN感受態(tài)細胞中。在溫度和紅霉素抗性雙重選擇壓力下傳16代后發(fā)生同源重組,然后將質(zhì)粒脫去PCR測序鑒定后,最終獲得GI9缺失的菌株XYSNAGI9。在獲得缺失突變株XYSNΔGI9基礎上,我們對GI9的生物學特性進行了探究。缺失突變株與其親本株的生長曲線、生理生化特性和對藥物的敏感性均無顯著差異,表明GI9對生長代謝的影響作用不明顯。卵磷脂酶實驗中XYSN和XYSNΔGI9菌落周圍均出現(xiàn)透明圈,說明缺失突變株的磷脂酶活性并未受影響。溶血試驗中XYSN的溶血效價為25,XYSNAGI9的溶血效價為24,缺失突變株溶血能力減弱了2倍,表明GI9與XYSN的溶血特性有關(guān)。而對BALB/c小鼠的LDso實驗結(jié)果表明,缺失突變株的毒力較親本株下降8倍,缺失突變株的毒力有了顯著降低,表明GI9與XYSN的致病性相關(guān),是XYSN基因組中除了prfA基因簇和inlAB外一新的毒力島。
【關(guān)鍵詞】：單核細胞增生李斯特菌 全基因組序列 比較基因組學 毒力相關(guān)基因 遺傳進化 缺失突變株 基因組島9 生物學特性
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378;Q78
【目錄】：

• 中文摘要2-6
• Abstract6-13
• 符號說明13-15
• 文獻綜述15-32
• 1 單核細胞增生李斯特菌研究進展15-23
• 1.1 李斯特菌屬概述15
• 1.2 致病性李斯特菌主要毒力相關(guān)因子15-23
• 2 微生物基因組學研究進展23-27
• 2.1 DNA測序技術(shù)進展23-24
• 2.2 微生物基因組學研究的應用24-27
• 2.3 小結(jié)27
• 參考文獻27-32
• 第一章 動物源分離株XYSN和NTSN的生物學特性研究32-41
• 1 材料和方法32-34
• 1.1 材料32-33
• 1.2 方法33-34
• 2 結(jié)果與分析34-38
• 2.1 生化試驗34-35
• 2.2 血清型鑒定35
• 2.3 藥敏試驗35-36
• 2.4 細胞侵襲實驗36-37
• 2.5 BALB/c小鼠的LD_(50)測定37
• 2.6 MLST分型37
• 2.7 基于actA基因的遺傳譜系分析37-38
• 3 討論38-40
• 參考文獻40-41
• 第二章 單核細胞增生李斯特菌XYSN和NTSN全基因組序列的測定與注釋分析41-70
• 1 材料和方法41-45
• 1.1 材料41-42
• 1.2 實驗方法42-45
• 2 結(jié)果與分析45-65
• 2.1 基因組DNA的提取45-46
• 2.2 基因組測序的基本信息46
• 2.3 LM XYSN和NTSN基因組測序的注釋及分析46-65
• 3 討論65-68
• 參考文獻68-70
• 第三章 單核細胞增生李斯特菌XYSN和NTSN比較基因組學分析和進化分析70-108
• 1 材料和方法70-75
• 1.1 材料70-73
• 1.2 實驗方法73-75
• 2 結(jié)果與分析75-103
• 2.1 基因組共線性分析75-78
• 2.2 BSR分析78
• 2.3 同源基因聚類比較分析78-79
• 2.4 LM泛基因組構(gòu)建與分析79-86
• 2.5 XYSN特異基因分析86-87
• 2.6 XYSN毒力相關(guān)基因比較分析87-100
• 2.7 進化分析100-103
• 3 討論103-105
• 參考文獻105-108
• 第四章 單核細胞增生李斯特菌XYSN中基因組島9缺失突變株的構(gòu)建、鑒定及生物學特性研究108-121
• 1 材料和方法108-111
• 1.1 材料108-109
• 1.2 實驗方法109-111
• 2 結(jié)果與分析111-116
• 2.1 缺失突變株XYSN△GI9的構(gòu)建結(jié)果111-114
• 2.2 缺失突變株XYSN△G19生物學特性結(jié)果114-116
• 3 討論116-119
• 參考文獻119-121
• 全文總結(jié)121-122
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學術(shù)論文122-123
• 致謝123-124
• 附錄124-137

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 談衛(wèi)軍;單核細胞增生李斯特菌XYSN和NTSN全基因組測序及比較基因組學分析[D];揚州大學;2015年

  本文關(guān)鍵詞：單核細胞增生李斯特菌XYSN和NTSN全基因組測序及比較基因組學分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：286242