發(fā)布時(shí)間：2017-04-03 05:17

  本文關(guān)鍵詞：抗甲狀旁腺激素納米抗體及吸附劑的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：甲狀旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)作為一種中分子毒素在慢性腎衰竭患者特別是終末期腎衰竭患者體內(nèi)積累超過(guò)普通人數(shù)十倍,導(dǎo)致患者出現(xiàn)骨折、肌痛、貧血等臨床癥狀,嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。因此,終末期慢性腎衰竭患者體內(nèi)過(guò)量PTH的去除工作具有十分重要的臨床意義。納米抗體因?yàn)槠浞肿恿啃�、親和力好、穩(wěn)定性好、免疫原性低和能夠到達(dá)很多抗體難以到達(dá)的表位而得到廣泛研究。因此,本論文研究了納米抗體作為血液凈化吸附劑配基去除PTH的可能性。1.表達(dá)宿主的選擇。將兩種納米抗體W2和W49在四種E.coli宿主BL21(DE3)、OrigamiTM2(DE3)、Rosseta-gamiTM(DE3)、Shuffle T7 Express中進(jìn)行表達(dá),根據(jù)可溶表達(dá)量,最終選擇BL21(DE3)和Shuffle T7 Express兩種宿主表達(dá)W49,Shuffle T7 Express表達(dá)W2。W49在BL21(DE3)中的表達(dá)量為553.3 mg/L,在Shuffle T7 Express中的表達(dá)量為272.3 mg/L；W2在Shuffle T7 Express中的表達(dá)量為133.2 mg/L。2.納米抗體的分離純化。細(xì)胞破碎并離心去沉淀后,利用固定化金屬離子螯合層析一步純化獲得純度高于90%的W49,其在BL21(DE3)和Shuffle T7 Express中的回收率分別為62%和58%。利用固定化金屬離子螯合層析并結(jié)合強(qiáng)陰離子交換兩步層析獲得純度高于90%的W2,總回收率為46.5%。3.納米抗體與PTH的相互作用。用ELISA、ITC、SPR等方法研究了W2、W49分別與PTH的相互作用。結(jié)果表明W2能夠結(jié)合PTH,親和常數(shù)約為5～6×10-7 M,而W49不與PTH相互作用。4.吸附劑的制備與吸附性能研究。固載W2在Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠上,配基密度為9.9 mg/mL。Sepharose CL-6B-W2吸附劑對(duì)PTH的靜態(tài)吸附最大結(jié)合容量為1.8 mg/mL,動(dòng)態(tài)結(jié)合容量為0.98 mg。0.1 M GIy-HCI(pH=2.0)條件下洗脫率為67.3%。Sepharose CL-6B-W2吸附劑對(duì)人血清白蛋白幾乎無(wú)吸附作用,而對(duì)人免疫球蛋白存在少量結(jié)合�？傊�,通過(guò)本論文的研究,獲得了對(duì)PTH具有去除效果的免疫吸附劑,為利用納米抗體制備吸附劑吸附去除血液中PTH提供了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：蛋白純化 甲狀旁腺激素 納米抗體 吸附劑
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 1 文獻(xiàn)綜述11-20
• 1.1 慢性腎衰竭與中分子11-12
• 1.1.1 慢性腎衰竭11
• 1.1.3 中分子11-12
• 1.2 甲狀旁腺激素12-14
• 1.2.1 甲狀旁腺激素概述12
• 1.2.2 PTH的去除12-14
• 1.3 納米抗體技術(shù)14-17
• 1.3.1 納米抗體(Nb)的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)特征14-15
• 1.3.2 納米抗體的應(yīng)用15-16
• 1.3.3 納米抗體的表達(dá)16-17
• 1.4 血液凈化吸附劑17-19
• 1.4.1 血液凈化技術(shù)17-18
• 1.4.2 血液凈化吸附劑18-19
• 1.5 本論文研究目的、內(nèi)容和意義19-20
• 2 抗PTH納米抗體的表達(dá)和純化20-40
• 2.1 引言20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器20-23
• 2.2.1 材料與試劑20-22
• 2.2.2 主要儀器、耗材22-23
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法23-30
• 2.3.1 制備感受態(tài)細(xì)胞23-24
• 2.3.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化24-25
• 2.3.3 重組蛋白的表達(dá)25
• 2.3.4 菌體破碎25-26
• 2.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色26-27
• 2.3.6 瓊脂糖凝膠電泳27
• 2.3.8 固定化金屬離子親和層析27-28
• 2.3.9 強(qiáng)陰離子交換層析28-29
• 2.3.10 重組蛋白純度分析及回收率計(jì)算29
• 2.3.11 BCA法測(cè)定總蛋白含量29-30
• 2.3.12 超濾30
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論30-38
• 2.4.1 重組蛋白的表達(dá)30-32
• 2.4.2 重組蛋白的可溶性檢測(cè)32-33
• 2.4.3 固定化金屬離子親和層析分離純化蛋白33-37
• 2.4.4 強(qiáng)陰離子交換層析純化目的蛋白37-38
• 2.5 小結(jié)38-40
• 3 抗PTH納米抗體的親和活性檢測(cè)40-50
• 3.1 引言40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料40-42
• 3.2.1 材料與試劑40-41
• 3.2.2 主要儀器與耗材41-42
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法42-45
• 3.3.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定42
• 3.3.2 等溫滴定量熱法42-43
• 3.3.3 表面等離子共振43-45
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論45-49
• 3.4.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定45
• 3.4.2 等溫滴定量熱法45-47
• 3.4.3 表面等離子共振47-49
• 3.5 小結(jié)49-50
• 4 吸附劑的合成及其吸附性能研究50-61
• 4.1 引言50
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 4.2.1 材料與試劑50
• 4.2.2 主要儀器與耗材50-51
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法51-58
• 4.3.1 吸附劑的合成51-53
• 4.3.2 環(huán)氧密度和活化羧基密度的測(cè)定方法53-56
• 4.3.3 Bradford法測(cè)定吸附劑吸附蛋白情況56-57
• 4.3.4 吸附劑親和常數(shù)測(cè)定57
• 4.3.5 吸附劑動(dòng)態(tài)結(jié)合容量測(cè)定57-58
• 4.3.6 吸附劑對(duì)HSA的吸附58
• 4.3.7 吸附劑對(duì)IgG的吸附58
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論58-60
• 4.4.1 吸附劑的合成58
• 4.4.2 吸附劑親和常數(shù)測(cè)定58-59
• 4.4.3 吸附劑對(duì)PTH動(dòng)態(tài)結(jié)合容量測(cè)定59-60
• 4.4.4 吸附劑對(duì)HSA的吸附60
• 4.4.5 吸附劑對(duì)IgG的吸附60
• 4.5 小結(jié)60-61
• 結(jié)論61-62
• 展望62-63
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 附錄A 重組蛋白PTH(1-84)氨基酸序列67-68
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況68-69
• 致謝69-70

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