本文關(guān)鍵詞：A族鏈球菌多價表位疫苗的完善制備及其動物免疫保護(hù)作用的相關(guān)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:A族鏈球菌(group A streptococcus,GAS)是一種常見的革蘭氏陽性菌,可以引起多種侵襲性感染和自身免疫性疾病。在大多數(shù)發(fā)展中國家GAS感染導(dǎo)致的風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性心臟病、腎小球腎炎等仍然是嚴(yán)重威脅人們生活質(zhì)量的一大問題。而對于GAS感染的治療目前大多為青霉素、大環(huán)內(nèi)酯類藥物或靜脈注射免疫球蛋白,但由于耐藥性或保護(hù)作用短暫等原因致使GAS感染仍舊保持著很高的復(fù)發(fā)率。所以制備成功有效的GAS疫苗成為GAS預(yù)防和治療的研究熱點。本室前期已構(gòu)建了包含7個Fba A表位和M蛋白1、3、6、18血清型的與人無交叉反應(yīng)的部分基因及M蛋白的C端共同基序(J基因)的p ET28a/F7M5[1],但是根據(jù)近期新的流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國大部分地區(qū)GAS流行菌株中M12血清型占了一大部分。故本實驗在本室構(gòu)建好的質(zhì)粒的外源基因序列上插入M12與人無交叉反應(yīng)的基因片段并表達(dá),該蛋白命名為F7M6,又以其為模板構(gòu)建表達(dá)了只含有6個不同M蛋白血清型的基因片段,該蛋白命名為M6。將F7M6蛋白,M6蛋白和本室保存的M1全長蛋白(簡稱M蛋白)分別免疫小鼠,通過ELISPOT、ELISA等實驗技術(shù)觀察細(xì)胞免疫和體液免疫效果,并攻毒后計算存活率,以確定疫苗保護(hù)效果。方法:1利用生物信息學(xué)方法在美國疾病預(yù)防和控制中心(CDC)數(shù)據(jù)庫獲GAS M12血清型的基因序列,通過與人體組織基因比對選取與人無交叉反應(yīng)的特異性序列,采用搭橋PCR的方法擴(kuò)增并插入F7M5序列中,得到F7M6序列。2在線預(yù)測F7M6序列表位。3在線預(yù)測F7M6蛋白空間結(jié)構(gòu)和親水性分析。4以F7M6序列為模板,PCR擴(kuò)增出含有M蛋白1、3、6、18、12血清型和M蛋白C端共同基序(J基因)的基因序列,得到M6序列。5將兩段基因片段克隆至載體p ET28a中,測序正確后將陽性質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳觀察結(jié)果,Western blot鑒定。采用親和層析純化方法對兩種蛋白進(jìn)行純化。6將純化的兩種蛋白,連同本室保存的GAS M蛋白,以相同劑量聯(lián)合佐劑分別免疫小鼠,腹部皮下多點注射,同時設(shè)立PBS對照組。每組12只,20μg/每只;免疫間隔21天,共免疫4次;于每次免疫10天后下頜竇靜脈取血,分離血清,-80oC保存?zhèn)溆谩?末次免疫后10天,處死6只小鼠,ELISPOT檢測小鼠脾臟免疫細(xì)胞表達(dá)IL-4和IFN-γ的水平,ELISA檢測各組血清中Ig G、Ig G1、Ig G2a的水平及動態(tài)變化。8用ELISA法檢測臨床獲取的抗鏈“O”陽性和健康兒童血清與F7M6蛋白的特異性結(jié)合能力。9采用全菌ELIAS法,檢測臨床獲取的GAS菌株與F7M6組血清的結(jié)合能力。10用致死量的M1GAS腹腔攻擊各組剩余下的6只小鼠,觀察并計算各組存活率。結(jié)果:1成功構(gòu)建了p ET28a/F7M6、p ET28a/M6陽性質(zhì)粒,并成功表達(dá)蛋白。Western blot結(jié)果顯示兩種蛋白均可以與F7M5抗體雜交。2 ELISA檢測各組血清,結(jié)果顯示,隨免疫次數(shù)增加,Ig G水平逐漸增高,F7M6組效價達(dá)到1:669309,M6組效價達(dá)到1:58158,M蛋白組達(dá)到1:32980,。F7M6組顯著高于M6組和M蛋白組(P0.001),但M6組和M蛋白組間無統(tǒng)計學(xué)差異。3血清Ig G1和Ig G2a檢測結(jié)果顯示,三組均可誘導(dǎo)較高水平的相應(yīng)抗體,均顯著高于PBS組(P0.001),Ig G1各組間沒有顯著差異,Ig G2a水平則F7M6組顯著高于M6組(P=0.009),但F7M6組與M蛋白組、M6與M蛋白組間沒有差異。4 ELISPOT結(jié)果顯示,IL-4,IFN-γ水平:F7M6、M6和M蛋白組均顯著高于PBS組(P0.001),且F7M6組的水平最高,而M蛋白組高于M6組(P0.05)。5用F7M6蛋白作為診斷抗原檢測抗鏈“O”陽性的病人血清及健康人血清,結(jié)果顯示,抗鏈“O”陽性的病人血清,陽性檢出率為(95%),而健康兒童血清的陽性率為(47.3%),二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.005)。6 ELISA檢測4株臨床株于不同組的血清的結(jié)合能力,結(jié)果顯示F7M6均能與其結(jié)合。7攻毒后,F7M6、M6和M蛋白各組生存率分別為66.7%、33.3%和66.7%,PBS組全部死亡。統(tǒng)計分析顯示各實驗組均高于PBS組(P0.05)。結(jié)論:1成功構(gòu)建并表達(dá)F7M6和M6蛋白。2 F7M6、M6和M蛋白免疫小鼠后均可引起較好的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答,對GAS感染有保護(hù)作用,以F7M6效果最佳,并且F7M6的多價表位涵蓋了時下流行的大部分GAS的血清型。
【關(guān)鍵詞】：A族鏈球菌(GAS) 多表位疫苗 M蛋白 FbaA蛋白 免疫應(yīng)答
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 第一部分 多價表位疫苗的設(shè)計構(gòu)建與表達(dá)12-33
• 前言12-13
• 材料與方法13-27
• 結(jié)果27-28
• 附圖28-31
• 討論31-33
• 第二部分 重組多價表位疫苗的免疫作用的研究33-47
• 前言33
• 材料與方法33-38
• 結(jié)果38-40
• 附圖40-45
• 討論45-47
• 結(jié)論47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 綜述50-58
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 致謝58-59
• 個人簡歷59

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 梁云梅;常賀生;沈敘莊;黃國英;鄭躍杰;符洲;俞桑潔;袁林;楊永弘;;致兒童咽扁桃體炎釀膿鏈球菌emm分型[J];臨床兒科雜志;2011年04期

  本文關(guān)鍵詞：A族鏈球菌多價表位疫苗的完善制備及其動物免疫保護(hù)作用的相關(guān)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：283945