本文關(guān)鍵詞：利用琥珀抑制技術(shù)制備CVB3疫苗的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：琥珀抑制是指在翻譯過程中抑制琥珀密碼子(UAG)的終止信號(hào),利用該項(xiàng)技術(shù)可以控制蛋白合成和擴(kuò)展遺傳密碼。在此技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展的各項(xiàng)蛋白標(biāo)記和蛋白操作技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用到蛋白研究的各個(gè)方面,其中通過控制病毒蛋白合成而進(jìn)行的病毒學(xué)研究促進(jìn)了病毒認(rèn)知和疫苗發(fā)展。柯薩奇B3病毒(Coxsackie virus B3, CVB3)是一類常見的感染人病毒,與常見的脊髓灰質(zhì)炎病毒、腸病毒71型等同屬小RNA病毒科-腸病毒屬。一方面,CVB3的急性感染是導(dǎo)致病毒性心肌炎的主要原因,一部分患者可發(fā)展為擴(kuò)張型心肌�。涣硪环矫�,越來越多的研究表明CVB3感染與I型糖尿病等慢性綜合征相關(guān)。盡管CVB3感染危害眾多,但是目前仍然沒有有效的疫苗和針對(duì)性藥物,臨床患者只能對(duì)癥治療。本研究針對(duì)CVB3臨床疫苗缺失,提出了利用琥珀抑制手段探究新型CVB3疫苗的研制思路,希望能探索出一種有效的CVB3完整病毒顆粒疫苗株制備方法。此思路的主要原理是,當(dāng)在CVB3基因組開放閱讀框中插入一個(gè)UAG琥珀密碼子時(shí),便形成了琥珀抑制依賴的CVB3：在人為控制下,該CVB3重組株通過表達(dá)識(shí)別UAG的aaRS/tRNA正交對(duì),抑制琥珀信號(hào),合成完整的活性病毒顆粒；而將前述CVB3病毒顆粒自然釋放時(shí),由于缺乏琥珀抑制系統(tǒng),CVB3病毒并不能增殖。由此,具有與天然CVB3病毒顆粒結(jié)構(gòu)完全相似卻不能增殖的突變CVB3正是安全、優(yōu)秀的疫苗候選物。為了通讀重組病毒ORF中的UAG密碼,我們構(gòu)建了真核表達(dá)系統(tǒng)適用的琥珀抑制系統(tǒng)。首先,我們將從大腸桿菌E.coli中克隆的Tyr氨酰tRNA合成酶基因插入了真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的多克隆位點(diǎn)；緊接著,我們?cè)贑MV啟動(dòng)子上游的BglⅡ位點(diǎn)連續(xù)插入了四個(gè)E.coli來源的H1-tRNACUATyr,轉(zhuǎn)錄方向與CMV啟動(dòng)子方向相反以避免相互影響。為了驗(yàn)證構(gòu)建的琥珀抑制系統(tǒng)的UAG通讀效率,我們將EGFP的39位Tyr突變?yōu)閁AG構(gòu)建了質(zhì)粒EGFP-Tyr39UAG。當(dāng)該質(zhì)粒與pcDNA3.1-EcYRS/tRNA共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞時(shí),可見綠色熒光；流式細(xì)胞術(shù)分析表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞比例表明,與野生型EGFP相比,EGFP-Tyr39UAG通讀效率達(dá)到了28.4%。通過定點(diǎn)突變技術(shù),我們將CVB3 Nancy重組株的VP4蛋白的Tyr27定點(diǎn)突變?yōu)殓昝艽a子UAG。通過T7依賴的體外轉(zhuǎn)錄,我們獲得了帶有突變位點(diǎn)的CVB3 Tyr27UAG的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。將pcDNA3.1-EcYRS/tRNA與CVB3 Tyr27UAG的mRNA先后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞,并未觀察到可見的病毒引起的細(xì)胞病變。依據(jù)CVB3重組病毒需要盲傳的經(jīng)驗(yàn),我們將CVB3 Tyr27UAG突變體培養(yǎng)物連續(xù)三次盲傳入事先瞬轉(zhuǎn)了pcDNA3.1-EcYRS/tRNA的293T細(xì)胞中。在第三次盲傳時(shí),發(fā)現(xiàn)了很少量的病毒引起的細(xì)胞病變。由此,我們利用琥珀抑制合成了具有增殖障礙(基因組起始部分有UAG終止信號(hào))的CVB3病毒顆粒。總上,我們的工作是以CVB3為例,通過琥珀抑制技術(shù)研究小RNA病毒新型疫苗的報(bào)道,對(duì)以后CVB3等小RNA病毒顆粒在琥珀抑制、非天然氨基酸插入等方面的研究具有良好的借鑒意義。希望通過進(jìn)一步發(fā)展和改良,琥珀抑制相關(guān)的各項(xiàng)技術(shù)為CVB3的疫苗研究做成貢獻(xiàn),也為應(yīng)對(duì)突發(fā)病毒流行、快速制備疫苗提供一種可行性。
【關(guān)鍵詞】：柯薩奇B病毒 琥珀抑制 大腸桿菌酪氨酸合成酶-tRNA 疫苗
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392-33
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 縮略詞表9-10
• 前言10-18
• 1 無義密碼子的有義識(shí)別編碼10-12
• 2 CVB3簡述12-15
• 3 本課題的研究內(nèi)容和意義15-18
• 第一章 琥珀抑制識(shí)別系統(tǒng)的構(gòu)建表達(dá)18-38
• 1.1 材料、試劑及儀器18-22
• 1.1.1 材料來源和引物設(shè)計(jì)18-19
• 1.1.2 溶液配制19-20
• 1.1.3 試劑及耗材20-21
• 1.1.4 儀器設(shè)備21-22
• 1.2 研究方法22-29
• 1.2.1 構(gòu)建pcDNA3.1-EcYRS/tRNA真核表達(dá)質(zhì)粒系列22-24
• 1.2.2 克隆構(gòu)建EGFP-Tyr39UAG琥珀抑制真核表達(dá)質(zhì)粒24-25
• 1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定EcTyrRS表達(dá)25-26
• 1.2.4 Western Blot鑒定EcYRSFlag表達(dá)26-28
• 1.2.5 共轉(zhuǎn)染EcYRS/tRNA和EGFPY39UAG28
• 1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)分析EGFP表達(dá)情況28-29
• 1.3 研究結(jié)果29-35
• 1.3.1 成功構(gòu)建pcDNA3.1-EcYRS29-30
• 1.3.2 成功構(gòu)建pcDNA3.1-EcYRS/tRNA真核表達(dá)質(zhì)粒系列30
• 1.3.3 EcYRS/tRNA過表達(dá)正常30-32
• 1.3.4 成功構(gòu)建EGFP-Tyr39UAG32
• 1.3.5 琥珀抑制效率分析32-35
• 1.4 討論35-36
• 1.5 小結(jié)36-38
• 第二章 CVB3琥珀抑制突變體的構(gòu)建及表達(dá)38-52
• 2.1 材料、試劑及儀器40-41
• 2.1.1 質(zhì)粒來源和引物設(shè)計(jì)40
• 2.1.2 溶液配制40
• 2.1.3 試劑及耗材40-41
• 2.1.4 儀器設(shè)備41
• 2.2 研究方法41-45
• 2.2.1 pCE-UAG突變體克隆構(gòu)建41-42
• 2.2.2 體外轉(zhuǎn)錄42-44
• 2.2.3 RNA電泳44
• 2.2.4 共轉(zhuǎn)染 pCE RNA 與 EcYRS/tRNA44-45
• 2.2.5 RTCA評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性45
• 2.3 研究結(jié)果45-49
• 2.3.1 成功構(gòu)建并轉(zhuǎn)錄pCE突變體45-47
• 2.3.2 共轉(zhuǎn)pCE-UAG與EcYRS/tRNA引起病毒CPE47-49
• 2.4 討論49-50
• 2.5 小結(jié)50-52
• 結(jié)論與展望52-54
• 主要結(jié)論52
• 工作展望52-54
• 附錄A54-57
• 附錄B57-58
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章64-66
• 致謝66-67

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙文然;鐘學(xué)寬;張淑娟;沃曉Z，

本文編號(hào)：283653