【摘要】：人線粒體DNA(mtDNA)是存在于線粒體內(nèi)的雙鏈環(huán)狀DNA分子，長(zhǎng)16，569bp，基因編碼產(chǎn)物包括2種rRNA、22種tRNA及13種多肽鏈。其中多肽鏈均是氧化磷酸化酶復(fù)合體的重要組成成分，而rRNA和tRNA則參與這些多肽鏈的合成。因此，mtDNA上任何基因的突變，都可能影響線粒體氧化磷酸化的功能，從而造成細(xì)胞的某些病理性改變。研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA受到氧化性損傷后會(huì)引起缺失和插入突變以及點(diǎn)突變等。近十年來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mtDNA缺失突變與衰老以及一些退行性疾病有關(guān)。同時(shí)，在其它一些疾病如腫瘤、家族性耳聾等，一些mtDNA缺失突變也被檢測(cè)到。 開展這方面相關(guān)的研究，準(zhǔn)確全面地檢測(cè)mtDNA缺失突變十分必要。但目前對(duì)于mtDNA缺失突變，檢測(cè)的準(zhǔn)確性、系統(tǒng)性都還沒有很好地解決。所以，雖然人們?cè)缫炎⒁獾絤tDNA缺失突變?cè)谒ダ霞岸喾N人類疾病中有重用作用，但到底是什么樣的作用，至今仍無(wú)定論。甚至有些矛盾的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。我們認(rèn)為，要明確mtDNA缺失突變?cè)谒ダ匣蚱渌恍┎±頎顟B(tài)中的意義，首先必須保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性。對(duì)于mtDNA缺失突變的檢測(cè)來(lái)說，就是要保證其準(zhǔn)確性和系統(tǒng)性。 本實(shí)驗(yàn)主要探討人mtDNA缺失突變檢測(cè)準(zhǔn)確性和系統(tǒng)性的方法學(xué)，在此基礎(chǔ)是上，對(duì)人mtDNA缺失突變?cè)谀[瘤和衰老中的發(fā)生情況及意義進(jìn)行初步的研究。 一．改進(jìn)了人mtDNA的制備方法 為了建立一種簡(jiǎn)便、快捷地從人外周血和組織中制備高質(zhì)量線粒體DNA的方法，本研究以差速離心法分離線粒體，用堿性SDS法裂解線粒體膜，釋放線粒體DNA后用酚一氯仿抽提，TE或ddH_2O溶解。然后將所得線粒體DNA進(jìn)行純度鑒定并和其他現(xiàn)有方法制備的線粒體DNA用PCR進(jìn)行長(zhǎng)片段擴(kuò)增，比較擴(kuò)增效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用改進(jìn)的方法制備的線粒體DNA中沒有檢測(cè)到核DNA，并能有效擴(kuò)增8kb長(zhǎng)的目的片段。改進(jìn)后的方法簡(jiǎn)便、快捷，制備的線粒體DNA純度高，也有利于長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增。 二．進(jìn)一步完善了我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的“改良PCR法” 我們?cè)?jīng)用改進(jìn)的PCR的方法從遭受~(60)Co輻照的病人外周血中發(fā)現(xiàn)了一種新的889bp的mtDNA缺失突變。在這種改良的方法中，第一次PCR的產(chǎn)物中可疑的 第二軍醫(yī)大學(xué)碩士論文 人線杜體ONA缺失突變檢瀏的研究 帶回收后同時(shí)用原引物對(duì)和內(nèi)遷引物對(duì)擴(kuò)增，電泳時(shí)只有在凝膠上發(fā)現(xiàn)兩組引物對(duì) 有相等的(僅相差約20bp)的最長(zhǎng)產(chǎn)物帶時(shí)，我們才認(rèn)為第一步PCR產(chǎn)物來(lái)自于 真正的mtDNA缺失。但是，在一種極端的情況下，這種改良的PCR法可能漏掉真 正的mtDNA缺失。就是當(dāng)缺失斷點(diǎn)與引物3’端很近(小于10個(gè)堿基)，甚至緊鄰 著引物的3’時(shí)，盡管第一步PCR產(chǎn)物確實(shí)來(lái)自于真正的mtDNA缺失，但由于內(nèi) 遷引物對(duì)之一沒有錨合位點(diǎn)，不可能擴(kuò)增出與使用原引物對(duì)擴(kuò)增相等的最長(zhǎng)產(chǎn)物。 所以，我們會(huì)將這樣的第一次PCR的產(chǎn)物視為“假產(chǎn)物”，即認(rèn)為它是來(lái)自其中一 條引物的錯(cuò)配。 正因?yàn)榇嬖谶@樣的情況，我們認(rèn)為當(dāng)?shù)谝淮蜳CR的產(chǎn)物回收后用內(nèi)遷引物對(duì)未 能擴(kuò)增出與使用原引物對(duì)相等的最長(zhǎng)產(chǎn)物時(shí)，馬上斷定該第一次PCR的產(chǎn)物就是 “假產(chǎn)物”尚且為時(shí)過早。為了解決這樣的問題，我們用原引物對(duì)和外遷引物對(duì)(即 原引物向外遷10bp)同時(shí)擴(kuò)增原始的mtDNA模板，如果在凝膠上發(fā)現(xiàn)兩組引物對(duì) 擴(kuò)增產(chǎn)物中有相等的(僅相差20bp)的小于最長(zhǎng)產(chǎn)物的條帶，(一般說來(lái)，在凝膠 電泳上，外遷引物對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物比原引物對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物要淡的多，即PCR產(chǎn)物的量 要少得多。這是因?yàn)樵锏臄U(kuò)增產(chǎn)物中既有包含缺失斷點(diǎn)的真缺失，也有來(lái)自其 中一條引物的錯(cuò)配的“假產(chǎn)物”。而外遷引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中僅有包含缺失斷點(diǎn)的真缺 失。)那么這樣的第一次PCR的產(chǎn)物就并非是“假產(chǎn)物”，而是包含缺失斷點(diǎn)的真缺 失。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了我們的假設(shè).我們從培養(yǎng)的SMMC一7721細(xì)胞株中檢測(cè)到一種 新的缺失突變。用我們先前建立的改良PCR法會(huì)漏掉此突變。缺失片斷大小為 4857bp，缺失片段為83lont-13166nt之l’ed序列，異常連接處兩端有2個(gè)5一bp(CTAAC) 的直接重復(fù)序列。 三.建立了系統(tǒng)篩選人mtDNA缺失突變的方法 目前檢測(cè)mtDNA缺失突變的方法主要有PCR和Southem Bfot。在這方面，PCR 具有更多的優(yōu)點(diǎn)，采用PCR方法，可以快速的檢測(cè)樣品中低水平的缺失突變，而 Southem Blot需要檢測(cè)樣品至少2一3 pg，而且需幾天才能完成，同時(shí)突變比例必須 超過5%才能被檢測(cè)到。因此，PCR方法應(yīng)用更為普遍。在具體應(yīng)用PCR方法檢測(cè) 線粒體DNA缺失突變時(shí)，主要有以下兩種途徑:一是在D一fo叩區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物， 用fong PCR技術(shù)擴(kuò)增整個(gè)約16.6kb的線粒體DNA分子:二是通過限制PCR條件 第二軍醫(yī)人學(xué)碩士論丈 人線拉體DNA缺失突變檢測(cè)的研究 (如控制延伸時(shí)間，使用普通Taq酶等)來(lái)擴(kuò)增某一區(qū)段突變型的線粒體DNA分 子，同時(shí)，設(shè)計(jì)多對(duì)引物分別檢測(cè)線粒體DNA不同區(qū)段的缺失突變。我們認(rèn)為， 無(wú)論是哪一種方法，都存在一定的缺陷。對(duì)于long PcR，首先是PcR的條件要求 高，擴(kuò)增時(shí)間長(zhǎng)，結(jié)果也不穩(wěn)定。而且，對(duì)于一些相對(duì)小片斷的缺失，容易被遺漏; 對(duì)于上面提到的第二種檢測(cè)思路，也常常是顧此失彼，難以保證涵蓋mtDNA所有 的區(qū)段。我們綜合以往的研究思路和方法，設(shè)計(jì)了3對(duì)引物
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 易軍;;衰老過程中線粒體DNA修復(fù)功能的研究[J];體育成人教育學(xué)刊;2011年04期

2 曹玉媛;張景亮;徐朝陽(yáng);程曉麗;;河南漢族精神分裂癥患者線粒體DNA 7445和5178位點(diǎn)突變分析[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年04期

3 龔萍;李紅霞;張素梅;;佛波酯誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3線粒體DNA突變的研究[J];實(shí)用婦產(chǎn)科雜志;2011年06期

4 陳美婭;周飛;毛乾國(guó);盧雅丕;陳建民;王琳;任建林;董菁;;乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子缺失突變的初步觀察[J];中國(guó)肝臟病雜志(電子版);2008年01期

5 姬宏莉;姬宏娟;馬永全;杜芳;王輝;;大腸癌線粒體DNA誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞D-環(huán)突變的作用與機(jī)制[J];實(shí)用醫(yī)藥雜志;2011年06期

6 姬宏莉;姬宏娟;宋衛(wèi)兵;馬永全;杜芳;王輝;肖冰;;大腸癌線粒體DNA誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞D-環(huán)突變[J];廣東醫(yī)學(xué);2011年10期

7 楊雷;胡理懷;楊宗;鄭九嘉;金龍金;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)精子線粒體DNA的提取效率[J];溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年04期

8 張艷萍;蓋凌;張美華;賈頤舫;;特發(fā)性男性不育癥的遺傳學(xué)分析[J];中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志;2011年08期

9 馬升軍;陳虹;;EGFR突變與EGFR-TKIs在非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2011年08期

10 王金合;王平;姜峰;韓林;王喜愛;呂玉民;;X射線致人外周血線粒體DNA 4977bp缺失的時(shí)效關(guān)系研究[J];輻射防護(hù);2011年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 劉仲榮;劉榮卿;張國(guó)威;郝飛;鐘白玉;;PUVA治療誘導(dǎo)皮膚線粒體DNA4977 bp缺失突變累積的研究[A];2003中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2003年

2 劉青杰;;線粒體DNA 4977 bp缺失及其檢測(cè)方法[A];全國(guó)醫(yī)用輻射防護(hù)與安全學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2004年

3 王懿娜;方紅;陳鴻超;;人皮膚衰老過程中的mtDNA缺失突變研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第14次全國(guó)皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2008年

4 王懿娜;方紅;陳鴻超;;人皮膚衰老過程中的mtDNA缺失突變研究[A];2008年浙江省皮膚病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

5 楊世偉;秦玉明;王大為;李軍;王鳳鳴;朱善良;Gregor Andelfinger;;TNNT2基因新發(fā)雙缺失突變致兒童限制性心肌病及其功能研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十五次全國(guó)兒科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編（上冊(cè)）[C];2010年

6 劉益平;曾凡同;張思婉;邱祥娉;;幾種山地烏骨雞線粒體DNA序列多態(tài)性分析[A];家禽研究最新進(jìn)展——第十一次全國(guó)家禽學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2003年

7 呂朝陽(yáng);劉宗才;楊代淑;;紅湆屬魚類線粒體DNA多態(tài)分析[A];中國(guó)動(dòng)物科學(xué)研究——中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)第十四屆會(huì)員代表大會(huì)及中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)65周年年會(huì)論文集[C];1999年

8 張金祥;王迪;李穎;簡(jiǎn)桂良;;不同致病力棉花黃萎病菌菌株在線粒體基因組存在差異[A];中國(guó)第六屆海峽兩岸菌物學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

9 王朝霞;袁云;高楓;戚豫;;63例線粒體腦肌病患者的線粒體DNA突變分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

10 孫玉華;劉思陽(yáng);余其興;;亞口魚科線粒體DNA差異及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究[A];中國(guó)海洋湖沼學(xué)會(huì)魚類學(xué)分會(huì)、中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)魚類學(xué)分會(huì)2004年學(xué)術(shù)研討會(huì)摘要匯編[C];2004年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者 李仁豐;線粒體DNA影響放療敏感性[N];健康報(bào);2000年

2 記者 陳勇;人類祖先可能沿印度洋“走出非洲”[N];新華每日電訊;2005年

3 張?zhí)锟?生命“共同體”怎樣鏈接[N];大眾科技報(bào);2001年

4 王思海;專家詳解人類衰老之謎[N];市場(chǎng)報(bào);2004年

5 本報(bào)記者 宦建新邋通訊員 王利月;陳劍平：與“農(nóng)”字相連與“科”字為伴[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

6 顧春;陳劍平 只想為農(nóng)民多做貢獻(xiàn)[N];人民日?qǐng)?bào);2007年

7 記者 汪敏華;老祖宗來(lái)龍去脈生老病死了如指掌[N];解放日?qǐng)?bào);2000年

8 記者 欒海;和印第安人最“親”[N];新華每日電訊;2002年

9 朱泓;吉林大學(xué)有關(guān)古人骨 DNA 的研究[N];中國(guó)文物報(bào);2001年

10 記者 楊駿;現(xiàn)有動(dòng)物克隆技術(shù)不完善[N];新華每日電訊;2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 彭煒;線粒體DNA 4834bp缺失突變?cè)诶夏晷悦@發(fā)病中作用及其機(jī)制的研究[D];華中科技大學(xué);2010年

2 鐘毅;線粒體DNA常見缺失在大片段缺失突變中的作用及其發(fā)生機(jī)制[D];華中科技大學(xué);2011年

3 李睿;NBS1缺失突變導(dǎo)致小顱畸形的分子機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年

4 羅理?xiàng)?現(xiàn)代家犬的起源[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2003年

5 母德清;線粒體DNA與線粒體診治胰腺癌的應(yīng)用研究[D];浙江大學(xué);2004年

6 趙立東;線粒體DNA突變相關(guān)的耳聾分子機(jī)制的研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2005年

7 胡媛;SIRT1在內(nèi)耳擬老化伴線粒體DNA4834缺失突變細(xì)胞模型中的作用及其機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2010年

8 劉屹立;線粒體DNA突變?cè)谀[瘤診斷中的意義[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2003年

9 洪沙;缺失突變HCV核蛋白DNA免疫效果的初步評(píng)價(jià)[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

10 郭新紅;不同倍性魚類mtDNA及三倍體湘云鯽Sox基因研究[D];湖南師范大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 朱克軍;人線粒體DNA缺失突變檢測(cè)的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

2 孫明;慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹及Kearns-Sayre綜合征患者線粒體DNA突變的研究[D];山東大學(xué);2006年

3 李東;線粒體基因突變與2型糖尿病相關(guān)性研究[D];武漢大學(xué);2005年

4 孔有琴;中國(guó)大鴇東方亞種（Otis tarda dybowskii）線粒體DNA遺傳多樣性的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2003年

5 劉建文;中國(guó)網(wǎng)翅蝗科部分種類線粒體DNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育研究[D];廣西大學(xué);2004年

6 趙晗;內(nèi)蒙古和林格爾東周時(shí)期墓地古代人群線粒體DNA多態(tài)性研究[D];吉林大學(xué);2005年

7 孫巍;脾陽(yáng)虛證衰老大鼠心肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ活性和線粒體DNA缺失的實(shí)驗(yàn)研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2006年

8 林華偉;骨髓增生異常綜合征線粒體DNA D-LOOP區(qū)突變的研究[D];山東大學(xué);2006年

9 周云麗;乳腺癌線粒體DNA突變和拷貝數(shù)改變的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2004年

10 劉瑩;廣西都安瑤族線粒體DNA控制區(qū)及Y-STR多態(tài)性研究[D];四川大學(xué);2004年

本文編號(hào)：2803884