【摘要】：人線粒體DNA(mtDNA)是存在于線粒體內(nèi)的雙鏈環(huán)狀DNA分子，長16，569bp，基因編碼產(chǎn)物包括2種rRNA、22種tRNA及13種多肽鏈。其中多肽鏈均是氧化磷酸化酶復(fù)合體的重要組成成分，而rRNA和tRNA則參與這些多肽鏈的合成。因此，mtDNA上任何基因的突變，都可能影響線粒體氧化磷酸化的功能，從而造成細胞的某些病理性改變。研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA受到氧化性損傷后會引起缺失和插入突變以及點突變等。近十年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mtDNA缺失突變與衰老以及一些退行性疾病有關(guān)。同時，在其它一些疾病如腫瘤、家族性耳聾等，一些mtDNA缺失突變也被檢測到。 開展這方面相關(guān)的研究，準確全面地檢測mtDNA缺失突變十分必要。但目前對于mtDNA缺失突變，檢測的準確性、系統(tǒng)性都還沒有很好地解決。所以，雖然人們早已注意到mtDNA缺失突變在衰老及多種人類疾病中有重用作用，但到底是什么樣的作用，至今仍無定論。甚至有些矛盾的實驗數(shù)據(jù)。我們認為，要明確mtDNA缺失突變在衰老或其它一些病理狀態(tài)中的意義，首先必須保證實驗結(jié)果的科學性。對于mtDNA缺失突變的檢測來說，就是要保證其準確性和系統(tǒng)性。 本實驗主要探討人mtDNA缺失突變檢測準確性和系統(tǒng)性的方法學，在此基礎(chǔ)是上，對人mtDNA缺失突變在腫瘤和衰老中的發(fā)生情況及意義進行初步的研究。 一．改進了人mtDNA的制備方法 為了建立一種簡便、快捷地從人外周血和組織中制備高質(zhì)量線粒體DNA的方法，本研究以差速離心法分離線粒體，用堿性SDS法裂解線粒體膜，釋放線粒體DNA后用酚一氯仿抽提，TE或ddH_2O溶解。然后將所得線粒體DNA進行純度鑒定并和其他現(xiàn)有方法制備的線粒體DNA用PCR進行長片段擴增，比較擴增效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用改進的方法制備的線粒體DNA中沒有檢測到核DNA，并能有效擴增8kb長的目的片段。改進后的方法簡便、快捷，制備的線粒體DNA純度高，也有利于長片段PCR擴增。 二．進一步完善了我們實驗室已經(jīng)建立的“改良PCR法” 我們曾經(jīng)用改進的PCR的方法從遭受~(60)Co輻照的病人外周血中發(fā)現(xiàn)了一種新的889bp的mtDNA缺失突變。在這種改良的方法中，第一次PCR的產(chǎn)物中可疑的 第二軍醫(yī)大學碩士論文 人線杜體ONA缺失突變檢瀏的研究 帶回收后同時用原引物對和內(nèi)遷引物對擴增，電泳時只有在凝膠上發(fā)現(xiàn)兩組引物對 有相等的(僅相差約20bp)的最長產(chǎn)物帶時，我們才認為第一步PCR產(chǎn)物來自于 真正的mtDNA缺失。但是，在一種極端的情況下，這種改良的PCR法可能漏掉真 正的mtDNA缺失。就是當缺失斷點與引物3’端很近(小于10個堿基)，甚至緊鄰 著引物的3’時，盡管第一步PCR產(chǎn)物確實來自于真正的mtDNA缺失，但由于內(nèi) 遷引物對之一沒有錨合位點，不可能擴增出與使用原引物對擴增相等的最長產(chǎn)物。 所以，我們會將這樣的第一次PCR的產(chǎn)物視為“假產(chǎn)物”，即認為它是來自其中一 條引物的錯配。 正因為存在這樣的情況，我們認為當?shù)谝淮蜳CR的產(chǎn)物回收后用內(nèi)遷引物對未 能擴增出與使用原引物對相等的最長產(chǎn)物時，馬上斷定該第一次PCR的產(chǎn)物就是 “假產(chǎn)物”尚且為時過早。為了解決這樣的問題，我們用原引物對和外遷引物對(即 原引物向外遷10bp)同時擴增原始的mtDNA模板，如果在凝膠上發(fā)現(xiàn)兩組引物對 擴增產(chǎn)物中有相等的(僅相差20bp)的小于最長產(chǎn)物的條帶，(一般說來，在凝膠 電泳上，外遷引物對擴增的產(chǎn)物比原引物對擴增的產(chǎn)物要淡的多，即PCR產(chǎn)物的量 要少得多。這是因為原引物的擴增產(chǎn)物中既有包含缺失斷點的真缺失，也有來自其 中一條引物的錯配的“假產(chǎn)物”。而外遷引物的擴增產(chǎn)物中僅有包含缺失斷點的真缺 失。)那么這樣的第一次PCR的產(chǎn)物就并非是“假產(chǎn)物”，而是包含缺失斷點的真缺 失。 實驗結(jié)果證實了我們的假設(shè).我們從培養(yǎng)的SMMC一7721細胞株中檢測到一種 新的缺失突變。用我們先前建立的改良PCR法會漏掉此突變。缺失片斷大小為 4857bp，缺失片段為83lont-13166nt之l’ed序列，異常連接處兩端有2個5一bp(CTAAC) 的直接重復(fù)序列。 三.建立了系統(tǒng)篩選人mtDNA缺失突變的方法 目前檢測mtDNA缺失突變的方法主要有PCR和Southem Bfot。在這方面，PCR 具有更多的優(yōu)點，采用PCR方法，可以快速的檢測樣品中低水平的缺失突變，而 Southem Blot需要檢測樣品至少2一3 pg，而且需幾天才能完成，同時突變比例必須 超過5%才能被檢測到。因此，PCR方法應(yīng)用更為普遍。在具體應(yīng)用PCR方法檢測 線粒體DNA缺失突變時，主要有以下兩種途徑:一是在D一fo叩區(qū)設(shè)計一對引物， 用fong PCR技術(shù)擴增整個約16.6kb的線粒體DNA分子:二是通過限制PCR條件 第二軍醫(yī)人學碩士論丈 人線拉體DNA缺失突變檢測的研究 (如控制延伸時間，使用普通Taq酶等)來擴增某一區(qū)段突變型的線粒體DNA分 子，同時，設(shè)計多對引物分別檢測線粒體DNA不同區(qū)段的缺失突變。我們認為， 無論是哪一種方法，都存在一定的缺陷。對于long PcR，首先是PcR的條件要求 高，擴增時間長，結(jié)果也不穩(wěn)定。而且，對于一些相對小片斷的缺失，容易被遺漏; 對于上面提到的第二種檢測思路，也常常是顧此失彼，難以保證涵蓋mtDNA所有 的區(qū)段。我們綜合以往的研究思路和方法，設(shè)計了3對引物
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346

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本文編號：2803884