【摘要】：在我國青藏高原由于平均海拔過高,導致空氣中平均氧含量只有13%左右,遠低于正常大氣壓中21%的氧含量。研究表明,長期暴露于高原環(huán)境中會影響人類神經系統的發(fā)育及其功能,從而影響大腦的學習記憶功能。大腦海馬體內神經元主要負責學習和記憶,而功能正常的神經元及神經元可塑性是大腦學習記憶的關鍵。高原低氧暴露會引起神經元的損傷,導致學習記憶功能障礙[1]。神經元中線粒體對神經元的發(fā)育、生長及功能實現起著重要作用,同時也是低氧暴露神經元損傷的敏感細胞器,低氧暴露會誘導線粒體損傷。HUMMR蛋白是一種定位于線粒體外膜的低氧應激蛋白,對神經元軸突內線粒體運輸起到調節(jié)作用,而HUMMR是否參與低氧導致的線粒體損傷過程尚未見報導。線粒體融合分裂平衡的破壞是線粒體損傷的前期表現,其相關蛋白是參與線粒體損傷的重要蛋白。MEF2(Myocyte enhancer factor,肌細胞增強因子)蛋白家族隸屬轉錄因子MADS轉錄因子家族,其中MEF2D可能通過調節(jié)其他核基因或線粒體基因轉錄參與線粒體功能的調節(jié),進而影響神經元生存及其正常功能維持,但是MEF2D、HUMMR和線粒體融合、分裂相關蛋白在低氧誘導的神經元損傷中的作用及分子機制有待于進一步研究。研究目的本研究通過建立低氧誘導線粒體損傷的體外模型,觀察低氧對神經元線粒體損傷的影響及特點,闡明HUMMR蛋白在線粒體損傷中作用及分子機制,揭示MEF2D對HUMMR蛋白及線粒體損傷的調控作用,研究結果對于預防和治療低氧誘導的線粒體損傷相關疾病具有重要意義。研究方法:1.低氧暴露細胞模型的建立:利用DWS低氧工作站,建立SH-SY5Y細胞及原代培養(yǎng)神經元1%低氧暴露模型。2.質粒構建:構建HUMMR-GFP高表達質粒、HUMMR-sh RNA干涉慢病毒質粒。3.慢病毒載體的構建:采用ps-PAX2、p MD2.G、HUMMR-sh RNA-PLKO重組慢病毒載體共轉染293T細胞,包裝成完整病毒。4.免疫熒光染色方法結合激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體形態(tài):用Mito-Tracker Red線粒體熒光探針及p Ds Red2-Mito質粒染色線粒體,用激光共聚焦觀察線粒體分布及形態(tài)變化。5.線粒體膜電位檢測:通過JC1(線粒體膜電位檢測法)染色,熒光顯微鏡觀察細胞膜電位變化。6.用電子顯微鏡方法觀察細胞內線粒體的超微結構。7.利用western-blot的方法檢測蛋白表達水平。研究結果:1.低氧暴露對線粒體形態(tài)和功能的影響:免疫組織化學結果顯示,1%低氧暴露24h和48h后,與對照組相比,SH-SY5Y細胞及原代培養(yǎng)神經元細胞的線粒體均出現不同程度的片斷化;線粒體膜電位水平明顯下降。2.低氧暴露對線粒體相關蛋白表達的影響:western-blot結果顯示:低氧暴露后可以使HUMMR蛋白、MEF2D蛋白和線粒體融合蛋白MFN2表達水平明顯降低。3.高表達HUMMR對低氧誘導的線粒體片段化的影響:高表達HUMMR的細胞用1%低氧處理,與正常表達HUMMR的細胞相比,高表達HUMMR可以部分改善低氧誘導的線粒體片段化,低氧誘導的MFN2蛋白表達下降也有一定程度的回升。4.低表達HUMMR對低氧誘導的線粒體片段化的影響:低表達HUMMR的細胞用1%低氧處理,與正常表達HUMMR的細胞相比,低表達HUMMR加劇了低氧誘導的線粒體片段化和MFN2蛋白表達下降。5.MEF2D對低氧誘導的HUMMR蛋白表達及線粒體片斷化的調控作用:(1)與對照組相比,低氧暴露后MEF2D水平呈下降趨勢。(2)高表達MEF2D后,可部分恢復低氧誘導的線粒體片斷化,同時低氧誘導的HUMMR蛋白水平下降也有一定程度的回升。研究結論:本研究通過建立低氧誘導線粒體損傷的體外模型,證實低氧可以引起神經元線粒體片斷化和膜電位水平下降,發(fā)現HUMMR蛋白在其中發(fā)揮著重要作用,闡明了低氧是通過核轉錄因子MEF2D調節(jié)HUMMR進而影響線粒體融合蛋白MFN2的表達水平,最終導致了線粒體片斷化的發(fā)生,研究結果對于預防和治療低氧誘導的線粒體損傷相關疾病具有重要的指導意義。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R339.5

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本文編號：2729512