發(fā)布時(shí)間：2020-06-25 23:53

【摘要】：在我國青藏高原由于平均海拔過高,導(dǎo)致空氣中平均氧含量只有13%左右,遠(yuǎn)低于正常大氣壓中21%的氧含量。研究表明,長(zhǎng)期暴露于高原環(huán)境中會(huì)影響人類神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及其功能,從而影響大腦的學(xué)習(xí)記憶功能。大腦海馬體內(nèi)神經(jīng)元主要負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶,而功能正常的神經(jīng)元及神經(jīng)元可塑性是大腦學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵。高原低氧暴露會(huì)引起神經(jīng)元的損傷,導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙[1]。神經(jīng)元中線粒體對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育、生長(zhǎng)及功能實(shí)現(xiàn)起著重要作用,同時(shí)也是低氧暴露神經(jīng)元損傷的敏感細(xì)胞器,低氧暴露會(huì)誘導(dǎo)線粒體損傷。HUMMR蛋白是一種定位于線粒體外膜的低氧應(yīng)激蛋白,對(duì)神經(jīng)元軸突內(nèi)線粒體運(yùn)輸起到調(diào)節(jié)作用,而HUMMR是否參與低氧導(dǎo)致的線粒體損傷過程尚未見報(bào)導(dǎo)。線粒體融合分裂平衡的破壞是線粒體損傷的前期表現(xiàn),其相關(guān)蛋白是參與線粒體損傷的重要蛋白。MEF2(Myocyte enhancer factor,肌細(xì)胞增強(qiáng)因子)蛋白家族隸屬轉(zhuǎn)錄因子MADS轉(zhuǎn)錄因子家族,其中MEF2D可能通過調(diào)節(jié)其他核基因或線粒體基因轉(zhuǎn)錄參與線粒體功能的調(diào)節(jié),進(jìn)而影響神經(jīng)元生存及其正常功能維持,但是MEF2D、HUMMR和線粒體融合、分裂相關(guān)蛋白在低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中的作用及分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。研究目的本研究通過建立低氧誘導(dǎo)線粒體損傷的體外模型,觀察低氧對(duì)神經(jīng)元線粒體損傷的影響及特點(diǎn),闡明HUMMR蛋白在線粒體損傷中作用及分子機(jī)制,揭示MEF2D對(duì)HUMMR蛋白及線粒體損傷的調(diào)控作用,研究結(jié)果對(duì)于預(yù)防和治療低氧誘導(dǎo)的線粒體損傷相關(guān)疾病具有重要意義。研究方法:1.低氧暴露細(xì)胞模型的建立:利用DWS低氧工作站,建立SH-SY5Y細(xì)胞及原代培養(yǎng)神經(jīng)元1%低氧暴露模型。2.質(zhì)粒構(gòu)建:構(gòu)建HUMMR-GFP高表達(dá)質(zhì)粒、HUMMR-sh RNA干涉慢病毒質(zhì)粒。3.慢病毒載體的構(gòu)建:采用ps-PAX2、p MD2.G、HUMMR-sh RNA-PLKO重組慢病毒載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝成完整病毒。4.免疫熒光染色方法結(jié)合激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)線粒體形態(tài):用Mito-Tracker Red線粒體熒光探針及p Ds Red2-Mito質(zhì)粒染色線粒體,用激光共聚焦觀察線粒體分布及形態(tài)變化。5.線粒體膜電位檢測(cè):通過JC1(線粒體膜電位檢測(cè)法)染色,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞膜電位變化。6.用電子顯微鏡方法觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體的超微結(jié)構(gòu)。7.利用western-blot的方法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。研究結(jié)果:1.低氧暴露對(duì)線粒體形態(tài)和功能的影響:免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,1%低氧暴露24h和48h后,與對(duì)照組相比,SH-SY5Y細(xì)胞及原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞的線粒體均出現(xiàn)不同程度的片斷化;線粒體膜電位水平明顯下降。2.低氧暴露對(duì)線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:western-blot結(jié)果顯示:低氧暴露后可以使HUMMR蛋白、MEF2D蛋白和線粒體融合蛋白MFN2表達(dá)水平明顯降低。3.高表達(dá)HUMMR對(duì)低氧誘導(dǎo)的線粒體片段化的影響:高表達(dá)HUMMR的細(xì)胞用1%低氧處理,與正常表達(dá)HUMMR的細(xì)胞相比,高表達(dá)HUMMR可以部分改善低氧誘導(dǎo)的線粒體片段化,低氧誘導(dǎo)的MFN2蛋白表達(dá)下降也有一定程度的回升。4.低表達(dá)HUMMR對(duì)低氧誘導(dǎo)的線粒體片段化的影響:低表達(dá)HUMMR的細(xì)胞用1%低氧處理,與正常表達(dá)HUMMR的細(xì)胞相比,低表達(dá)HUMMR加劇了低氧誘導(dǎo)的線粒體片段化和MFN2蛋白表達(dá)下降。5.MEF2D對(duì)低氧誘導(dǎo)的HUMMR蛋白表達(dá)及線粒體片斷化的調(diào)控作用:(1)與對(duì)照組相比,低氧暴露后MEF2D水平呈下降趨勢(shì)。(2)高表達(dá)MEF2D后,可部分恢復(fù)低氧誘導(dǎo)的線粒體片斷化,同時(shí)低氧誘導(dǎo)的HUMMR蛋白水平下降也有一定程度的回升。研究結(jié)論:本研究通過建立低氧誘導(dǎo)線粒體損傷的體外模型,證實(shí)低氧可以引起神經(jīng)元線粒體片斷化和膜電位水平下降,發(fā)現(xiàn)HUMMR蛋白在其中發(fā)揮著重要作用,闡明了低氧是通過核轉(zhuǎn)錄因子MEF2D調(diào)節(jié)HUMMR進(jìn)而影響線粒體融合蛋白MFN2的表達(dá)水平,最終導(dǎo)致了線粒體片斷化的發(fā)生,研究結(jié)果對(duì)于預(yù)防和治療低氧誘導(dǎo)的線粒體損傷相關(guān)疾病具有重要的指導(dǎo)意義。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R339.5

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本文編號(hào)：2729512