發(fā)布時(shí)間：2020-06-26 06:14

【摘要】：神經(jīng)系統(tǒng)是機(jī)體最重要和最復(fù)雜的系統(tǒng),它謎一樣的發(fā)生過程一直吸引著發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)家的關(guān)注。而其中神經(jīng)管的發(fā)生是關(guān)系到建立中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system, CNS)原基的重要胚胎學(xué)事件,在這個(gè)過程中,神經(jīng)板必須準(zhǔn)時(shí)準(zhǔn)確地關(guān)閉形成神經(jīng)管,神經(jīng)系統(tǒng)才能得以正常發(fā)育,否則將出現(xiàn)神經(jīng)管缺陷(neural tube defect,NTD)和隨之而來的脊柱裂或無腦等常見畸形。NTD的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)占出生嬰兒的0.1~0.9%,給家庭和社會帶來了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。但是迄今對此復(fù)雜過程的基因表達(dá)與確切調(diào)控途徑均知之甚少,所以正常神經(jīng)管形成的分子機(jī)制和NTD的發(fā)病機(jī)理已成為當(dāng)今神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿。研究發(fā)現(xiàn),胚胎9.5天(E9.5d)時(shí),作為轉(zhuǎn)錄因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3(signal transducer and activator of transcription factor-3,STAT3)在早期胚胎發(fā)育中的腦區(qū)有較高水平的表達(dá),而E9.5d正是神經(jīng)管關(guān)閉的重要時(shí)期,這是否提示STAT3有可能參與神經(jīng)管的關(guān)閉呢?它的表達(dá)異常是否和NTD的發(fā)生相關(guān)呢? 神經(jīng)管閉合后,神經(jīng)管上皮細(xì)胞的進(jìn)一步增生、分化和遷移,它的前端呈現(xiàn)三個(gè)膨大,依次稱為前腦泡、中腦泡和菱腦泡,前腦泡發(fā)育為端腦和間腦,中腦泡發(fā)育為中腦,菱腦泡的前部發(fā)育為后腦,以后演變?yōu)槟X橋和小腦,菱腦泡的后部發(fā)育延髓,神經(jīng)管尾端形成未來的脊髓。神經(jīng)管上皮細(xì)胞的增生、分化和遷移對于神經(jīng)系統(tǒng)正常結(jié)構(gòu)和功能的建立十分重要。近年研究發(fā)現(xiàn),有許多基因參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控,外環(huán)境也是通過這些基因發(fā)揮作用的。作為轉(zhuǎn)錄因子的STAT3參與很多基因的表達(dá)和調(diào)控,并與其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)尤其是神經(jīng)上皮內(nèi)檢測到STAT3的表達(dá),它是否可能通過啟動不同靶基因表達(dá)來參與神經(jīng)管上皮細(xì)胞的增生、分化和遷移呢? 研究提示,成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)參與調(diào)節(jié)早期神經(jīng)發(fā)育階段的許多關(guān)鍵過程,對雞胚的研究發(fā)現(xiàn)FGF可能作為直接的神經(jīng)誘導(dǎo)分子,其中FGF-8只在胚胎的早期增殖和神經(jīng)發(fā)生階段表達(dá),涉及神經(jīng)的早期發(fā)育和分化。已知FGFs是激活STAT的重要生長因子之一,并且FGF2與受體結(jié)合后可以激活STAT3, WP=10 由于FGF家族成員之間序列有高度的同源性,提示FGF8也可能激活STAT3而啟動基因轉(zhuǎn)錄。FGF8是否可能作為STAT3上游的分子和STAT3共同促使神經(jīng)管關(guān)閉呢?迄今對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育尤其是神經(jīng)管關(guān)閉和NTD復(fù)雜過程的基因表達(dá)與調(diào)控的研究剛剛起步,涉及此過程的基因與具體調(diào)控途徑均知之甚少,目前對正常神經(jīng)管形成和NTD發(fā)生過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及分子機(jī)制的研究也尚無明確定論。 本實(shí)驗(yàn)采用全胚胎原位雜交技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫細(xì)胞熒光染色技術(shù)等方法,觀察到了STAT3在胚胎發(fā)育中時(shí)空表達(dá)規(guī)律,尤其在神經(jīng)胚形成階段和神經(jīng)上皮增生、分化和遷移中的表達(dá)變化規(guī)律;并利用喂服過量維甲酸(retinoic acid, RA)誘導(dǎo)NTD模型,觀察發(fā)生NTD的胚胎STAT3的表達(dá)變化;同時(shí)采用全胚胎原位雜交技術(shù)觀察FGF8在正常胚胎神經(jīng)胚形成(neurulation)過程中的表達(dá)和在NTD中的表達(dá)變化,并比較了FGF8和STAT3變化規(guī)律及其關(guān)系,旨在探討STAT3在正常神經(jīng)上皮發(fā)育及神經(jīng)管關(guān)閉過程中的作用,試圖揭示STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用和可能的分子機(jī)制。結(jié)果如下: 一、STAT3在小鼠胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的表達(dá) 1、采用全胚胎原位雜交技術(shù)可觀察到E8.75~11.5d小鼠胚胎STAT3的表達(dá)情況,在E8.75d時(shí)整個(gè)鼠胚幾乎沒有觀察到STAT3 mRNA的表達(dá),在E9.5d,隨著神經(jīng)管的逐漸關(guān)閉,STAT3 mRNA在前腦泡急劇增多,到E10.5d,陽性信號由前腦泡轉(zhuǎn)移至中腦泡,E11.5d時(shí)僅在后腦泡的一狹窄區(qū)域檢測到STAT3 mRNA的表達(dá)。STAT3胚胎神經(jīng)組織的表達(dá),尤其是神經(jīng)管頭段STAT3的表達(dá)及其時(shí)空變化,提示STAT3有可能參與了這個(gè)時(shí)期神經(jīng)管的關(guān)閉以及神經(jīng)管頭段的發(fā)育。 2、本實(shí)驗(yàn)用酶免疫組織化學(xué)方法觀察到在E13.5d,在側(cè)腦室周圍即未來大腦新皮層區(qū)域、間腦、發(fā)育中的視網(wǎng)膜、第四腦室周圍的腦組織(未來的腦橋)、脊髓、三叉神經(jīng)節(jié)和背根神經(jīng)節(jié)C1均可觀察到較強(qiáng)的STAT3陽性信號。E13d正是神經(jīng)上皮套層細(xì)胞開始向邊緣層遷移的時(shí)候,此時(shí)各腦區(qū)大量細(xì)胞表達(dá)STAT3,提示STAT3可能參與了神經(jīng)前體細(xì)胞的分化和遷移。用熒光免疫組織化學(xué)方法觀察,E14.5d和E15.5d時(shí),大腦皮層、間腦、視網(wǎng)膜、第四腦室周圍以及發(fā)育中的腦橋和脊髓等部位均可觀察到發(fā)中等強(qiáng)度熒光的細(xì)胞,提示在細(xì)胞基本完成遷移和分化后,STAT3的表達(dá)有所下降。 二、STAT3與RA致小鼠NTD的關(guān)系 1、與正常對照組相比,喂服RA后孕鼠在E9.5~10.5d可觀察到前腦頂部和后腦未閉合的畸形胚胎,在少數(shù)胚胎可觀察到整個(gè)神經(jīng)管未閉合,呈開放狀態(tài)。表明該劑量的RA可以造成CNS發(fā)育的缺陷。 WP=11 2、采用全胚胎原位雜交技術(shù)可以觀察到RA誘導(dǎo)所致NTD畸形的鼠胚STAT3表達(dá)變化的情況,在E9.5、10.5d時(shí) STAT3 mRNA的表達(dá)較正常胚胎減少,在前腦泡和中腦泡未觀察到明顯的STAT3 mRNA表達(dá);E11.5d的胚胎神經(jīng)管已關(guān)閉,與正常鼠胚相比STAT3 mRNA的表達(dá)無明顯變化。研究發(fā)現(xiàn),STAT3分子可以啟動一些促進(jìn)細(xì)胞存活的基因轉(zhuǎn)錄,如Bcl-2和Bcl-XL,從而維持細(xì)胞的存活。NTD發(fā)生時(shí)伴有的STAT3表達(dá)下調(diào),這可
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R329
【圖文】：

STAT3 和 FGF8cRNA 核酸探針的制備STAT3cRNA 核酸探針的制備鈣法轉(zhuǎn)化含 STAT3 全長的質(zhì)粒，堿裂解法抽提質(zhì)粒，應(yīng)用生物軟件族成員的核酸和氨基酸序列，選取開放閱讀框 133~720bp 的片段作 primer primier 5 軟件設(shè)計(jì)引物，并在引物的 5’端分別加入 RNA 聚 SP6，交公司合成引物，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR，合成長度為 431bT7 和 SP6 的片段，經(jīng)膠回收試劑盒純化(見圖 1-1)；以此片段為模板劑盒進(jìn)行探針標(biāo)記，經(jīng)檢測探針含量符合要求。FGF8cRNA 核酸探針的制備鈣法轉(zhuǎn)化含 FGF8 全長的質(zhì)粒，堿裂解法抽提質(zhì)粒，因質(zhì)粒上攜帶有子 T7 和 T3，用限制性內(nèi)切酶 PstI 將 800bp 的插入片段在 450bp 處化，經(jīng)膠回收試劑盒純化(見圖 1-1)；以此片段為模板應(yīng)用地高辛標(biāo)標(biāo)記，經(jīng)檢測探針含量符合要求。

E10.5d全胚胎原位雜交示STAT3mRNA(×20)

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本文編號：2729941