【摘要】： 哺乳動物肝臟具有強大的再生能力，在受到物理或化學(xué)損傷后，肝臟可以通過再生迅速恢復(fù)功能和體積。肝再生是一個復(fù)雜的過程，成千上萬的物質(zhì)參與了這個過程。但目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的肝刺激因子作用靶細(xì)胞或靶組織廣泛，對肝再生的作用缺乏特異性，僅從這些因子出發(fā)很難闡明肝再生的機制。 幾十年來，越來越多的證據(jù)表明，有特異性刺激肝細(xì)胞增殖和肝再生的物質(zhì)存在。1975年，LaBrecque等從新生大鼠肝臟中分離得到在體內(nèi)和體外均能夠特異促進肝細(xì)胞增殖的混合物，并將其命名為肝刺激物(hepatic stimulator substance，HSS)。近30年來，國內(nèi)外學(xué)者對動物及人源HSS的理化性質(zhì)、生物學(xué)性能以及應(yīng)用前景等都有了較為深入的了解，但始終未能分離純化獲得具有HSS活性的單體組分，對其作用機理的研究也還有待闡明。 近年來，本實驗室從新生小牛肝臟HSS中分離得到一種能夠促進肝細(xì)胞增殖的蛋白因子，并從人胎肝cDNA文庫中篩選出其人源序列。我們將這一新的肝細(xì)胞生長因子命名為HPPCn(hepatopoietin Cn)。序列分析顯示，HPPCn屬于富含亮氨酸的酸性核蛋白(Leucine-rich acidic nuclear protein，LANP)家族成員。LANP家族成員作為一類多功能的核蛋白，參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及腫瘤抑制等多種生物學(xué)過程。但是，作為一種生長因子能夠在細(xì)胞外起作用，而且影響細(xì)胞的增殖狀況，目前還未見報道。 HPPCn作為LANP家族成員，在蛋白結(jié)構(gòu)中有兩個核定位信號，卻沒有信號肽。它是怎樣到達細(xì)胞外并發(fā)揮作用的呢?在已有的報道中，也有一些核蛋白(如HMGB1，HDGF等)，沒有信號肽，卻可以通過非經(jīng)典途徑分泌到細(xì)胞外，在增殖、炎癥和遷移等生物過程中發(fā)揮重要作用。這些證據(jù)為HPPCn細(xì)胞外功能的研究提供了依據(jù)。 本課題報道了HPPCn作為一種新的肝細(xì)胞生長因子，在體內(nèi)和體外均具有特異性的肝刺激活性，并對其作用機制進行了初步探討。 首先，為了闡明HPPCn與肝再生的關(guān)系，我們檢測了HPPCn在不同細(xì)胞系和組織，以及部分肝切除術(shù)后的表達譜。HPPCn呈多細(xì)胞、多組織分布，在腦、心、肝和腎中表達水平較高，在人肝癌細(xì)胞系SMMC7721細(xì)胞中定位于細(xì)胞核。小鼠34％肝切除術(shù)后，殘肝中HPPCn mRNA水平迅速升高，分別于術(shù)后2h和24h達峰值，蛋白水平的變化稍慢，12h達峰值，隨后緩慢下降。部分肝切除術(shù)后HPPCn表達水平的時間動態(tài)變化提示HPPCn可能與肝再生過程中肝細(xì)胞從G1期向S期的過渡有關(guān)。 進而，我們檢測了重組蛋白(rhHPPCn)在體內(nèi)和體外的促增殖活性。rhHPPCn可以促進肝癌細(xì)胞系SMMC7721、正常肝細(xì)胞系L02和大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的~3H-TdR DNA摻入，且具有劑量依賴性。與HSS相似，rhHPPCn對不同細(xì)胞促DNA合成作用表現(xiàn)出部分肝特異性。MTT比色試驗和流式細(xì)胞術(shù)檢測CFSE標(biāo)記細(xì)胞方法也證明rhHPPCn具有刺激肝細(xì)胞增殖的活性。尾靜脈注射rhHPPCn(2.5mg／kg體重)可以明顯促進34％部分肝切除C57／BL6小鼠殘肝~3H-TdR和BrdU的DNA摻入。rhHPPCn可以促進正常小鼠肝臟DNA合成，而對腎、腦和脾沒有作用。rhHPPCn可以明顯降低CCl_4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠血清GPT和GOT水平，并可以促進損傷肝臟中PCNA的表達。提示rhHPPCn促進肝再生，并且對CCl_4誘導(dǎo)的急性肝損傷具有保護作用。 最后，我們初步探討了HPPCn發(fā)揮細(xì)胞因子作用的可能機制。HPPCn可以在生理條件下分泌。并且外源rhHPPCn可以抑制SMMC7721內(nèi)源HPPCn的表達，說明HPPCn的表達存在反饋調(diào)節(jié)。SMMC7721細(xì)胞表面可能存在HPPCn的受體，rhHPPCn與其受體的結(jié)合具有特異性、可飽和性和可逆性。我們又檢測了rhHPPCn對信號通路的激活作用。結(jié)果顯示，rhHPPCn可以同時激活SMMC7721細(xì)胞中的SPK，Erk1／2和Stat3信號分子，可以明顯刺激部分肝切除小鼠殘肝中Erk1／2的磷酸化。這些實驗結(jié)果說明HPPCn可能經(jīng)非經(jīng)典分泌途徑到達細(xì)胞外，通過與肝細(xì)胞表面受體相互作用，激活以上信號通路實現(xiàn)促進肝細(xì)胞增殖的功能。 本研究首次報道了，富含亮氨酸的酸性核蛋白HPPCn，能夠作為生長因子在細(xì)胞外發(fā)揮作用，促進肝細(xì)胞的增殖。HPPCn不僅能夠特異性刺激大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞、SMMC7721和L02細(xì)胞系的增殖，而且能夠促進小鼠手術(shù)或化學(xué)損傷后的肝再生。這一作用可能是通過肝細(xì)胞表面受體，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路來實現(xiàn)的。HPPCn具有與HSS類似的特異性肝刺激活性和肝保護作用，又是一種單一組分的蛋白因子，對HPPCn的研究，不僅有利于闡明肝再生機制，而且有助于為人類肝臟疾病尋找新的臨床治療途徑。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R341
【圖文】：

圖2:高效液相色譜的純度檢測報告rhHPPCn純度達到94.2%(圖片由崔春萍、杜助君提供)本課題希望回答兩個問題:1、HPPCn作為富含亮氨酸的酸性核蛋白，有細(xì)胞外刺激肝細(xì)胞增殖的活性?2、如果HPPCn可以在細(xì)胞外起作用，沒有信號膚的情況下，可以在生理狀態(tài)下分泌嗎?其作用機制如何?根據(jù)目的，我們對人源HPPCn的表達譜、細(xì)胞外活性和在肝再生過程中的作了分析，并對其作用機制進行了初步探討。

ln留^a側(cè)p‘工出

本文編號：2728163