【摘要】： 人ndrg2基因(N-myc downstream-regulated gene 2)是本課題組于2000年從正常成人全腦cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)和獲得的新序列。其全長為2,024bp，經(jīng)BLAST相似性分析證明所得序列為一新基因(GenBank檢索號：AF159092)。ndrg2基因含有16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子，定位于染色體14q11.2，編碼一個(gè)含有357個(gè)氨基酸殘基、分子量約為40kDa的蛋白質(zhì)。初步研究顯示，該基因可表達(dá)于多種組織中，并且是正常腦組織和膠質(zhì)瘤的差異表達(dá)基 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 因。目前己報(bào)道該家族共有四個(gè)成員：ndrgl、ndrgZ、ndrg3禾 ndrg4，其 中nd侶4又分為三個(gè)亞型：叫＊個(gè)B、n巾葉莊“『和叩r＊＊H�，m家族各成員廠 的氨基酸殘基序列同源性很高，但在各組織間的表達(dá)水平有明顯差異。 己知有多種因素可以影響 ndrg的表達(dá)水平，在施加同型半臍氨酸、致 DNA損傷性物質(zhì)、地衣霉素hunicamycin＼應(yīng)激刺激（缺氧、Niy等＼抑 癌基因p53等因素的條件下，ndrgl 的表達(dá)上調(diào)；而雄激素、N－myc、C－myc 等因素可下調(diào) ndrg 的表達(dá)。己有文獻(xiàn)報(bào)道，在細(xì)胞的增箔分化、細(xì)胞氧化 還原電勢平衡的維持、阻抑腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散等過程中，ndrg和 ndrgZ發(fā)揮著重 要作用 ［’””］。由于目前對于 ndrg家族的結(jié)構(gòu)和功能性認(rèn)識尚不全面，因此， 克隆和表達(dá)n山g家族各成員并制備相應(yīng)的特異性抗體則成為迫切而重要的 基礎(chǔ)性工作，有利于從總體上研究該家族各成員的生理功能。 根據(jù)上述事實(shí)，本實(shí)驗(yàn)按如下方案展廠： 1．ndrg家族成員的cDNA克隆。提取人胎腦組織的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄 制備cDNA。依據(jù)GenBanLk登錄的ndrg家族各成員序列分別合成了針對 ndfgl、ndrg3和 ndfg4B的引物，然后進(jìn)行 PCR反應(yīng)以擴(kuò)增 DNA，回收和純 化PCR產(chǎn)物并將其插入到pMD 181載體中進(jìn)行克隆后測序分析，用 BLAST 程序驗(yàn)證測序結(jié)果。 2．ndfg家族成員的原核表達(dá)。將測序下確的片段插入到pRSETA。 pGEX＊T、pPpoEX衛(wèi)Tb等表達(dá)載體中，分別用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn) pPROEX－HTbndygl所編碼的NDRGI蛋白有高效可溶性表達(dá)。 3．NDRGI 蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析。融合表達(dá)的6HIS．NDRGI 蛋白經(jīng) NiNTA偶聯(lián)的瓊脂糖珠純化后，進(jìn)行圓h色性分析。發(fā)現(xiàn)在該分于中，幾 種蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)所占比列如下：。螺旋：23石9入p片層：18石％，轉(zhuǎn)角： 25．7％，無規(guī)則卷曲：32刀％，這與計(jì)算機(jī)程序預(yù)測的結(jié)果相近。 4．抗人 NDRG家族的多克隆抗體制備。用可溶性的 6HIS－NDRG蛋白 4 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 免疫家兔獲得了高效價(jià)的兔抗人 NDRG多克隆抗血清，利用固定于硝酸纖 維素膜上的NDRGI抗原進(jìn)行親和吸附，以純化抗血清，提高了NDRGI多 克隆抗體的特異性，并用此純化的抗體進(jìn)行了免疫組化和 Western撿測。出 于＊＊＊G家族各成員間氨基酸組成有很高的同源性，此抗體在識別＊D＊GI。 NDRGZ、NDRG3和 NDRG4時(shí)存在交叉，表明己獲得抗人NDRG家族的多 蕪隆抗體。 5．抗人NDRG家族寡肽的多克隆抗體制備。山于抗人NDRG家族的多 是隆抗體不能很好地區(qū)分NDRG1、NDRGZ、NDRG3和NDRG4，按各亞型 分于氦基酸殘基序列中特異的肽段合成的寡肽作為半抗原，與KLH偶聯(lián)后 兔疫家兔，以制備特異性的抗寡肽抗體。B前免疫家兔的抗體滴度約為1：3 200，繼續(xù)加強(qiáng)免疫，可望獲得具有高度特異性的抗體，以特異地識別NDRGI。 NDRGZ、NDRG3和 NDRG4各亞型分子。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：Q78
【圖文】：

(1)6His.NDRG3和6His.NDR以一B融合蛋白的表達(dá)形式分析6His一DRG3的理論相對分子量約為43.0kDa，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得的表達(dá)蛋白大小與預(yù)期基本相符(左箭頭所指)。圖5一a中1、2、3三個(gè)泳道分別代表6His入DRG3融合蛋白在總蛋白、上清和沉淀中的分布，可見6His一DRG3融合蛋白主要分布在沉淀中，以包涵體的形式存在。6His一NDRG4一B的理論相對分子量約為41.0kDa，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得的表達(dá)蛋白大小與預(yù)期基本相符(右箭頭所指)。圖5一a中第4、5、6三個(gè)泳道分別代表6His一NDRG4一B融合蛋白在總蛋白、上清和沉淀中的分布，可見6His一DR以一B融合蛋白主要分布在沉淀中，以包涵體的形式存在。123CM456一咖一黔黔涵盆鵝翻嘛蕩嘛一少毛、翎畔凈續(xù)一廿獄鮑二妙閱一-笠葉食夔_矍暨圖5一a6His一NDRc3、6nis一NDRe李B的表達(dá)形式分析Fig.5一aSDSPAGEanalysisofexPr

(2)6His.NDRGI融合蛋白的表達(dá)形式分析及純化6His.NDRGI融合蛋白的理論相對分子量為43.0叨a，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得的表達(dá)蛋白大小與預(yù)期相符(箭頭所指)。圖5一b中第1、2、3三個(gè)泳道分別代表6His.NDRGI融合蛋白在總蛋白、上清和沉淀中的分布，見6His.NDRGI融合蛋白在上清和沉淀中均有分布，上清中表達(dá)的可溶性蛋白約占菌體總蛋白的28%�？扇苄缘�6His-NDRGI融合蛋白可以用來做進(jìn)一步的純化。kDaMC12397.166.243.0纂纂鬢撮黔瞥緲壑肇一31.0黔鸚;粵考撇瞬·、嵌片兮州矽一悶曰門..口...悶.‘....腳...一.，........圖5一b6His一NDRGI的可溶性表達(dá)Fig.5-bSDS一PAGEanalysisofexPressionandsolubilityof6His一NDRGIfusionprotein.M:Proteinmarker:C:PPROEX一HTbinDHSQindueedbyIPTGinLBmedia:l:PRoEX一HTb一nd飛1inDHSQindueedbyIPTG:2:suPernatantofbacteriallysatecontaining6His一DRGIfusionProtein):3:PreeiPitateofbacteriallysate(eontainingH15一DRG1fusionProtein);表達(dá)的6His.NDRGI融合蛋白質(zhì)經(jīng)Ni一TA偶聯(lián)的瓊脂糖珠親和純化;在咪哇濃度為200nuno比和250~。比的洗脫液中得到較高純度蛋白質(zhì)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 張文紅,劉新平,王吉村,韓月恒,鄧艷春,周潔,藥立波;兔抗人NDR2高效價(jià)抗血清的制備、純化及鑒定[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年08期

2 鄧艷春,藥立波,劉新平,聶曉燕,王吉村,張曉光,蘇成芝;人腦內(nèi)一含有ACP樣結(jié)構(gòu)域新基因的發(fā)現(xiàn)[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2001年01期

3 李劍,劉新平,林樹新,鄧艷春,孟慶軍,張文紅,李樹鈞,聶曉燕,藥立波;一種新的抑癌候選基因——NDR2在人類正常組織及相應(yīng)腫瘤中的表達(dá)[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2002年02期

4 高麗華,胡顯文,吳清法,肖成祖,胥照平,張正光;免疫親和層析法純化單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑[J];生物工程學(xué)報(bào);2002年03期

5 何畏,梁志清,吳玉章,史常旭,賈正才,周偉,李玉清;一種精子蛋白嵌合肽的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2002年07期

本文編號：2718521