【摘要】： 本研究運(yùn)用體細(xì)胞核移植的原理和技術(shù)，以成年大鼠的成纖維細(xì)胞為供體，去核小鼠和牛成熟卵母細(xì)胞為受體，構(gòu)建種間核移植重組胚胎，研究種間體細(xì)胞核移植胚胎的構(gòu)建方法和重組胚胎的體內(nèi)外發(fā)育潛能及其影響因素。并重點(diǎn)討論影響種間核移植重組胚胎發(fā)育的主要因素。主要內(nèi)容和結(jié)果如下： (一) SD大鼠成纖維細(xì)胞系的建立 將單細(xì)胞顯微法改進(jìn)為單細(xì)胞集落克隆純化，能快速、有效建立細(xì)胞系，并可獲得92.71％克隆率。 (二) SD大鼠成纖維細(xì)胞的同步化處理和核型分析 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)可知，經(jīng)血清饑餓法同步處理的大鼠成纖維細(xì)胞，G_0+G_1期細(xì)胞百分比提高到74.5±4.4％；而用nocodazole法能使45.9±5.21％的細(xì)胞同步于G_2／M期，兩種方法均顯著(P0.05)。核型分析顯示大鼠原代和傳代成纖維細(xì)胞染色體數(shù)目(2n=42)和形態(tài)一致。 (三) 大鼠-小鼠種間體細(xì)胞核移植研究主要結(jié)果 1．直接注射法和融合法構(gòu)建的重組胚桑椹胚發(fā)育率分別可達(dá)9.84％、9.48％。1500～M800V／cm,30ms脈沖條件可使70％以上的重構(gòu)胚融合，低場(chǎng)強(qiáng)、大脈沖(1000V／cm,100～200ms)也能使60.0～78.24％的重構(gòu)胚胎融合。 2．改良CZB培養(yǎng)基能更好地支持重組胚的發(fā)育，桑椹胚發(fā)育率可達(dá)10.93％。 3．未經(jīng)處理、血清饑餓3-5d、10±5μg／ml nocodazole處理的大鼠成纖 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 雛細(xì)胞做供體構(gòu)建重組胚胎，分別得到 4．14％、6．45％、2．94％的囊肚發(fā)育率。 4．研究發(fā)現(xiàn) 10土5 u g／ml的 CCB有利于去核（去核率為 88．23％L 6－DMAP＋乙醇＋CCB能有效地激活種間核移植重構(gòu)胚。 5．將255枚2－細(xì)胞以上的核移植重構(gòu)肚，移植給46只SD假孕鼠，均未 妊娠。 （四）大鼠－牛種間體細(xì)胞核移植研究的主要結(jié)果 牛卵母細(xì)胞在含8－10％發(fā)情牛血清（OCS）的成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)22－24h，能 使60．86％－61．41％的卵母細(xì)胞達(dá)到成熟：在1500－1800V／cm，30－40sin條件下， 大鼠－牛核移植重構(gòu)胚能達(dá)到 50廠0－55．08％融合率：血請(qǐng)饑餓法和 nocodazole 法處理的供體細(xì)胞構(gòu)建的重組胚胎，經(jīng)6－DMAP＋乙醇＋CCB激活，分別獲得 17．33O和 17．02O的卵裂率以及6．60O和8．50o的�？芭甙l(fā)育；重組胚胎在 MI 99和改良的 CZB中培養(yǎng)，分別獲得 16．41O和 17．41o的卵裂率以及 7．46o 和 6．7 4O的囊胚率。 結(jié)論：本研究在國內(nèi)首次進(jìn)行大鼠－小鼠和大鼠－牛種問體細(xì)胞核移植探 索，初步建立種間體細(xì)胞核移植重組胚的構(gòu)建方法，并獲得發(fā)育至�？芭叩拇� 鼠－小鼠和大鼠－牛胚胎，但沒有得到囊胚。重組肚移植給受體動(dòng)物均未妊娠。 說明小鼠和牛的去核成熟卵母細(xì)胞質(zhì)能支持大鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行發(fā)育程序重 編，但不能維持重組胚胎的囊胚發(fā)育和妊娠。此外，重組胚胎的構(gòu)建、卵母細(xì) 胞的質(zhì)量、供體細(xì)胞的預(yù)處理、激活方法、培養(yǎng)體系等回素都影響異種核移植 胚胎的發(fā)育。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R329-33

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2715630