【摘要】： 原核生物的rRNA基因位點(rnn)具有高度的保守性，同時不同菌屬細菌之間又存在相對穩(wěn)定的變異性，因此廣泛被用于細菌的種系發(fā)生學與分類學的鑒定上。其中16S rRNA和16S-23S rRNA間區(qū)是最常用的兩個基因。針對16S rRNA基因，許多學者選擇不同的變異區(qū)利用不同的引物對該基因片段進行PCR擴增，然后通過諸如單鏈構(gòu)象多態(tài)性等方法試圖達到提高細菌鑒定效率的目的，雖然對大多數(shù)細菌來說分辨效果較好，但是對大腸埃希菌和志賀菌屬這樣常見的細菌卻無法區(qū)分。還有人利用16S-23S rRNA間區(qū)基因進行PCR反應(yīng)，然后將產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，雖然該基因的擴增產(chǎn)物在各個種屬細菌之間無論是片段長度還是片段數(shù)目上都呈現(xiàn)多態(tài)性，可將大部分細菌區(qū)分開來，但是由于所用的PCR反應(yīng)時間較長，并且不能準確確定片段長度即沒有可以利用的數(shù)量化指標，所以應(yīng)用上受到一定限制。同樣對常見的葡萄球菌屬內(nèi)的細菌，鑒定結(jié)果極不穩(wěn)定，也不利于該法的推廣。為了有效利用上述兩個基因，并且克服方法學上的不足，我們篩選了上述兩個基因的合適引物，分別用FAM和JOE兩種熒光素標記，并且將模板制備過程加以簡化，即直接在99℃條件下裂解10分鐘，避免了長時間的DNA提取的復雜操作，適當調(diào)整了PCR反應(yīng)條件，不僅讓兩種引物能同時在同一條件下反應(yīng)，而且使得16S-23S rRNA間區(qū)基因的次級產(chǎn)物量盡可能減少。經(jīng)過對三株標準(ATCC)菌株和兩株陰性對照真菌的DNA PCR擴增比較后，發(fā)現(xiàn)效果很好。所得產(chǎn)物先用普通瓊脂糖凝膠電泳，再分別用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ進行不完全酶切，力圖盡可能得到比較多的酶切產(chǎn)物片段。酶切產(chǎn)物50倍稀釋后進行毛細管電泳(PCR-CE-RFLP)，測定酶切片段長度差異，目的是要初步建立一個臨床常見菌的標準PCR-CE-RFLP數(shù)據(jù)庫，以便用于細菌鑒定。本實驗共檢測革蘭陰性、陽性病原菌183株，分屬5個屬19個種。經(jīng)過分析后發(fā)現(xiàn)，針對16S rRNA基因的RFLP譜數(shù)據(jù)僅僅能將細菌鑒定到“科”的程度，無法再進行更細的分類；而16S-23S rRNA間區(qū)基因的PCR產(chǎn)物雖然大部分細菌之間無論在片段長度還是在片段數(shù)量上都有較大區(qū)別，但個別種屬內(nèi)仍然有相似的譜型出現(xiàn)，經(jīng)過PCR-CE-RFLP分析后，則 可將所有細菌鑒定到“種”的程度，也包括前文提到的那些無法區(qū)分的菌株。雖 然本文的結(jié)果顯示單純應(yīng)用 16s－235 rRNA間區(qū)基因的RFLP結(jié)果就能區(qū)分所有細 菌，但是由于臨床面對的細菌種類繁多，我們建議將 16s rRNA基因的結(jié)果一并考 慮，以便在鑒定時能提供一些輔助信息。本文證實：利用 165 rRNA基因和 16s－235 rRNA間區(qū)基因PCR－CE－RFLP進行細菌鑒定簡便快捷，能將傳統(tǒng)方法需要十幾個小 時甚至幾十小時的鑒定工作用四個小時左右完成，是一種極有臨床應(yīng)用價值的快 速診斷方法。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R346

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 羅雯,萬雅各,彭宣憲,王三英;采用通用引物PCR配合SSCP及RFLP技術(shù)快速檢測常見病原菌[J];中華微生物學和免疫學雜志;2001年06期

2 傅君芬,盧美萍,尚世強,洪文瀾,陸淼泉,李建平;16S-23S rRNA基因區(qū)間細菌鑒定實驗研究[J];浙江大學學報(醫(yī)學版);2002年06期

本文編號：2715615