【摘要】： 原核生物的rRNA基因位點(diǎn)(rnn)具有高度的保守性，同時(shí)不同菌屬細(xì)菌之間又存在相對(duì)穩(wěn)定的變異性，因此廣泛被用于細(xì)菌的種系發(fā)生學(xué)與分類學(xué)的鑒定上。其中16S rRNA和16S-23S rRNA間區(qū)是最常用的兩個(gè)基因。針對(duì)16S rRNA基因，許多學(xué)者選擇不同的變異區(qū)利用不同的引物對(duì)該基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后通過(guò)諸如單鏈構(gòu)象多態(tài)性等方法試圖達(dá)到提高細(xì)菌鑒定效率的目的，雖然對(duì)大多數(shù)細(xì)菌來(lái)說(shuō)分辨效果較好，但是對(duì)大腸埃希菌和志賀菌屬這樣常見(jiàn)的細(xì)菌卻無(wú)法區(qū)分。還有人利用16S-23S rRNA間區(qū)基因進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，雖然該基因的擴(kuò)增產(chǎn)物在各個(gè)種屬細(xì)菌之間無(wú)論是片段長(zhǎng)度還是片段數(shù)目上都呈現(xiàn)多態(tài)性，可將大部分細(xì)菌區(qū)分開(kāi)來(lái)，但是由于所用的PCR反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，并且不能準(zhǔn)確確定片段長(zhǎng)度即沒(méi)有可以利用的數(shù)量化指標(biāo)，所以應(yīng)用上受到一定限制。同樣對(duì)常見(jiàn)的葡萄球菌屬內(nèi)的細(xì)菌，鑒定結(jié)果極不穩(wěn)定，也不利于該法的推廣。為了有效利用上述兩個(gè)基因，并且克服方法學(xué)上的不足，我們篩選了上述兩個(gè)基因的合適引物，分別用FAM和JOE兩種熒光素標(biāo)記，并且將模板制備過(guò)程加以簡(jiǎn)化，即直接在99℃條件下裂解10分鐘，避免了長(zhǎng)時(shí)間的DNA提取的復(fù)雜操作，適當(dāng)調(diào)整了PCR反應(yīng)條件，不僅讓兩種引物能同時(shí)在同一條件下反應(yīng)，而且使得16S-23S rRNA間區(qū)基因的次級(jí)產(chǎn)物量盡可能減少。經(jīng)過(guò)對(duì)三株標(biāo)準(zhǔn)(ATCC)菌株和兩株陰性對(duì)照真菌的DNA PCR擴(kuò)增比較后，發(fā)現(xiàn)效果很好。所得產(chǎn)物先用普通瓊脂糖凝膠電泳，再分別用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ進(jìn)行不完全酶切，力圖盡可能得到比較多的酶切產(chǎn)物片段。酶切產(chǎn)物50倍稀釋后進(jìn)行毛細(xì)管電泳(PCR-CE-RFLP)，測(cè)定酶切片段長(zhǎng)度差異，目的是要初步建立一個(gè)臨床常見(jiàn)菌的標(biāo)準(zhǔn)PCR-CE-RFLP數(shù)據(jù)庫(kù)，以便用于細(xì)菌鑒定。本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)革蘭陰性、陽(yáng)性病原菌183株，分屬5個(gè)屬19個(gè)種。經(jīng)過(guò)分析后發(fā)現(xiàn)，針對(duì)16S rRNA基因的RFLP譜數(shù)據(jù)僅僅能將細(xì)菌鑒定到“科”的程度，無(wú)法再進(jìn)行更細(xì)的分類；而16S-23S rRNA間區(qū)基因的PCR產(chǎn)物雖然大部分細(xì)菌之間無(wú)論在片段長(zhǎng)度還是在片段數(shù)量上都有較大區(qū)別，但個(gè)別種屬內(nèi)仍然有相似的譜型出現(xiàn)，經(jīng)過(guò)PCR-CE-RFLP分析后，則 可將所有細(xì)菌鑒定到“種”的程度，也包括前文提到的那些無(wú)法區(qū)分的菌株。雖 然本文的結(jié)果顯示單純應(yīng)用 16s－235 rRNA間區(qū)基因的RFLP結(jié)果就能區(qū)分所有細(xì) 菌，但是由于臨床面對(duì)的細(xì)菌種類繁多，我們建議將 16s rRNA基因的結(jié)果一并考 慮，以便在鑒定時(shí)能提供一些輔助信息。本文證實(shí)：利用 165 rRNA基因和 16s－235 rRNA間區(qū)基因PCR－CE－RFLP進(jìn)行細(xì)菌鑒定簡(jiǎn)便快捷，能將傳統(tǒng)方法需要十幾個(gè)小 時(shí)甚至幾十小時(shí)的鑒定工作用四個(gè)小時(shí)左右完成，是一種極有臨床應(yīng)用價(jià)值的快 速診斷方法。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 羅雯,萬(wàn)雅各,彭宣憲,王三英;采用通用引物PCR配合SSCP及RFLP技術(shù)快速檢測(cè)常見(jiàn)病原菌[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2001年06期

2 傅君芬,盧美萍,尚世強(qiáng),洪文瀾,陸淼泉,李建平;16S-23S rRNA基因區(qū)間細(xì)菌鑒定實(shí)驗(yàn)研究[J];浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2002年06期

本文編號(hào)：2715615