【摘要】：骨骼的形成和發(fā)育是與許多因素相關的復雜過程，轉錄因子是影響骨生長非常重要的因素。目前已知與成骨細胞分化相關的轉錄因子有兩個：Cbfa1(Core Binding Factor 1)和Osx(Osterix)。Cbfa1于1997年被證明是控制骨形成的關鍵因子，適量表達可以促進成骨細胞的早期分化；而過量表達會抑制成骨細胞的成熟。2002年Kazuhisa等用抑制性消減雜交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)的方法分離出轉錄因子Osx。Cbfa1和Osx基因分別作用于成骨細胞分化的不同時期：Cbfa1調控間充質細胞向前成骨細胞分化，Osx在前成骨細胞向成骨細胞分化過程中起作用。 本論文直接目的是分離可被Cbfa1誘導的新基因，長遠目標在于找到與骨骼細胞分化相關轉錄因子。本文以具有早期骨細胞特征MLO-Y4(Murine Long Bone Osteocyte-Y4)細胞為研究對象，將Cbfa1基因轉染到細胞內后，用抑制性消減雜交(SSH)方法進行新基因分離，成功構建了Cbfa1誘導下表達基因片段文庫。從文庫中隨機選出的83個陽性克隆中，含有Cbfa1基因片段克隆24個，含有其它已知基因片段克隆19個，含有未知基因片段克隆40個，占克隆總數的67.8％。實驗用Virtual Northern blot方法證明了其中一個沒有同源序列的未知基因是Cbfa1誘導下表達的新基因。因為，在Cbfa1誘導的已知基因中有Osx存在，所以， MLO一Y4中Cbfal誘導表達新基因的分離 實驗進一步以RT一PCR法證實在MLO一Y4細胞中Cbfal可以誘導osx表達。 本實驗同時用RT一PCR法在另兩種成骨細胞MC3T3一El、UZOS中也檢測 到了Cbfal誘導osx的表達。
【學位授予單位】：遼寧師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346
【圖文】：

在這些細胞中缺少Cbfal以外其他與Osx表達相關的轉錄因子。由于Cbfal和osx在成骨細胞分化過程中的作用時期不同，所以敲除它們的小鼠在表型上也存在一定差異。cbfal一/--小鼠的肪骨和股骨中沒有肥大軟骨細胞標記基因的表達〔28]，在可能出現肥大化軟骨細胞周圍的細胞外基質中也只有很低程度的鈣化〔291。在osx一/一小鼠中，肥大軟骨細胞標記基因表達均正常，在肥大軟骨細胞出現中心基質中鈣化程度也比較大。出現這些差異的推測原因是，肥大軟骨細胞標記基因的啟動子序列中有只存在Cbfal結合位點〔30.3，·’〕。osx缺失同樣完全抑制成骨細胞分化，但是破骨細胞分化，血管侵入，軟骨細胞分化和軟骨形成均正常【5]。Kazuhisa等推測Cbfal和Osx在成骨細胞分化中的作用關系如圖1。Cbfal在間充質細胞分化成前成骨細胞過程中起作用，osx在前成骨細胞向成骨細胞分化過程中起作用。

兩端序列中有長反向重復序列，退火后形成“鍋柄”結構，也不能被擴增;一端具有接頭結構的DNA雙鏈只能得到線性擴增:只有兩端具有不同接頭的DNA可得到指數性擴增產物。具體過程和原理如圖3。3構建c洲人片段文庫以及篩選特異表達基因構建文庫時，PCR產物與T載體連接，再將連接質粒轉化大腸桿菌，進行a互補篩選。用PcR法驗證其中白色菌落克隆是否為含有插入片段的陽性克隆，然后將篩選出的陽性克隆質粒和菌種分別做好標記。通過virtualNorthernblot方法檢測部分陽性克隆中插入片段的特異性，以

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本文編號：2715469