【摘要】：骨骼的形成和發(fā)育是與許多因素相關(guān)的復(fù)雜過程，轉(zhuǎn)錄因子是影響骨生長非常重要的因素。目前已知與成骨細(xì)胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有兩個：Cbfa1(Core Binding Factor 1)和Osx(Osterix)。Cbfa1于1997年被證明是控制骨形成的關(guān)鍵因子，適量表達(dá)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的早期分化；而過量表達(dá)會抑制成骨細(xì)胞的成熟。2002年Kazuhisa等用抑制性消減雜交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)的方法分離出轉(zhuǎn)錄因子Osx。Cbfa1和Osx基因分別作用于成骨細(xì)胞分化的不同時期：Cbfa1調(diào)控間充質(zhì)細(xì)胞向前成骨細(xì)胞分化，Osx在前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中起作用。 本論文直接目的是分離可被Cbfa1誘導(dǎo)的新基因，長遠(yuǎn)目標(biāo)在于找到與骨骼細(xì)胞分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。本文以具有早期骨細(xì)胞特征MLO-Y4(Murine Long Bone Osteocyte-Y4)細(xì)胞為研究對象，將Cbfa1基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)后，用抑制性消減雜交(SSH)方法進(jìn)行新基因分離，成功構(gòu)建了Cbfa1誘導(dǎo)下表達(dá)基因片段文庫。從文庫中隨機(jī)選出的83個陽性克隆中，含有Cbfa1基因片段克隆24個，含有其它已知基因片段克隆19個，含有未知基因片段克隆40個，占克隆總數(shù)的67.8％。實(shí)驗(yàn)用Virtual Northern blot方法證明了其中一個沒有同源序列的未知基因是Cbfa1誘導(dǎo)下表達(dá)的新基因。因?yàn)椋贑bfa1誘導(dǎo)的已知基因中有Osx存在，所以， MLO一Y4中Cbfal誘導(dǎo)表達(dá)新基因的分離 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步以RT一PCR法證實(shí)在MLO一Y4細(xì)胞中Cbfal可以誘導(dǎo)osx表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)同時用RT一PCR法在另兩種成骨細(xì)胞MC3T3一El、UZOS中也檢測 到了Cbfal誘導(dǎo)osx的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R346
【圖文】：

在這些細(xì)胞中缺少Cbfal以外其他與Osx表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。由于Cbfal和osx在成骨細(xì)胞分化過程中的作用時期不同，所以敲除它們的小鼠在表型上也存在一定差異。cbfal一/--小鼠的肪骨和股骨中沒有肥大軟骨細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)〔28]，在可能出現(xiàn)肥大化軟骨細(xì)胞周圍的細(xì)胞外基質(zhì)中也只有很低程度的鈣化〔291。在osx一/一小鼠中，肥大軟骨細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)均正常，在肥大軟骨細(xì)胞出現(xiàn)中心基質(zhì)中鈣化程度也比較大。出現(xiàn)這些差異的推測原因是，肥大軟骨細(xì)胞標(biāo)記基因的啟動子序列中有只存在Cbfal結(jié)合位點(diǎn)〔30.3，·’〕。osx缺失同樣完全抑制成骨細(xì)胞分化，但是破骨細(xì)胞分化，血管侵入，軟骨細(xì)胞分化和軟骨形成均正常【5]。Kazuhisa等推測Cbfal和Osx在成骨細(xì)胞分化中的作用關(guān)系如圖1。Cbfal在間充質(zhì)細(xì)胞分化成前成骨細(xì)胞過程中起作用，osx在前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中起作用。

兩端序列中有長反向重復(fù)序列，退火后形成“鍋柄”結(jié)構(gòu)，也不能被擴(kuò)增;一端具有接頭結(jié)構(gòu)的DNA雙鏈只能得到線性擴(kuò)增:只有兩端具有不同接頭的DNA可得到指數(shù)性擴(kuò)增產(chǎn)物。具體過程和原理如圖3。3構(gòu)建c洲人片段文庫以及篩選特異表達(dá)基因構(gòu)建文庫時，PCR產(chǎn)物與T載體連接，再將連接質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行a互補(bǔ)篩選。用PcR法驗(yàn)證其中白色菌落克隆是否為含有插入片段的陽性克隆，然后將篩選出的陽性克隆質(zhì)粒和菌種分別做好標(biāo)記。通過virtualNorthernblot方法檢測部分陽性克隆中插入片段的特異性，以

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本文編號：2715469