【摘要】： 一、原代小鼠肝細胞的分離及培養(yǎng) 目的：建立一種操作簡單且成本較低的小鼠肝細胞的簡易分離方法，以用于原代肝細胞的分離培養(yǎng)的研究，并進一步為生物型人工肝研制奠定實驗基礎。 方法：選用昆明小鼠作為肝細胞的供體，采用改良膠原酶消化法對小鼠肝臟進行原位灌注，并回收膠原酶溶液循環(huán)利用，分離獲取小鼠肝細胞進行原代培養(yǎng)；用臺盼藍染色法來檢測細胞存活率，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化。 結果：每只小鼠平均可獲取6.58×10~6個肝細胞，平均存活率為64.1％。用含10％新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，12h后細胞開始貼壁生長，48h伸出偽足，呈現(xiàn)典型的上皮樣細胞的外形形態(tài)，胞漿內(nèi)有空泡和脂滴，可以見到雙核細胞。相鄰細胞伸長的偽足相互連接。在普通培養(yǎng)液中的肝細胞生存時間可達5～7d，之后細胞回縮，體積變小，逐漸死亡并且從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來，或者出現(xiàn)其他肝臟的非實質(zhì)細胞優(yōu)勢生長的現(xiàn)象。 結論：膠原酶原位灌注法可以用于分離原代小鼠肝細胞，并且分離獲得的肝細胞存活數(shù)目以及細胞活性均能夠滿足實驗觀察的需要。 二、營養(yǎng)成分對短期單層培養(yǎng)的原代小鼠肝細胞的形態(tài)學 中文摘要 影響。 目的：本研究在普通培養(yǎng)液中添加轉鐵蛋白、牛胰島 素、煙酷胺、p－琉基乙醇和促肝細胞生長因子，觀察這些 營養(yǎng)成分對原代短期培養(yǎng)的小鼠肝細胞的形態(tài)學的影響， 旨在探討一種適用于原代肝細胞的培養(yǎng)方案。 方法：用膠原酶消化法獲取原代小鼠肝細胞，在兩種 不同的培養(yǎng)液中進行短期單層培養(yǎng)，一種是含 10％新生牛 血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，簡稱為普通培養(yǎng)液。一種是在 RPMI 1640培養(yǎng)液中加入了 5 11 iml轉鐵蛋白、5 P g／ml牛 胰島素、10nM煙酚胺、smM卜琉基乙醇，40 11 g／ml促肝 細胞生長因子，簡稱為肝細胞培養(yǎng)液。利用倒置相差顯微 鏡來觀察并攝像記錄短期培養(yǎng)兩種不同的培養(yǎng)液中的小鼠 原代肝細胞的形態(tài)學的變化。 結果：小鼠肝細胞在接種 12h后開始出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象。 肝細胞培養(yǎng)液組貼壁的肝細胞數(shù)目明顯多于普通培養(yǎng)液 組，但此時兩組培養(yǎng)液中的小鼠肝細胞在形態(tài)學上的差異 并不顯著。接種24h后，兩組培養(yǎng)液中的肝細胞的形態(tài)學 差異開始出現(xiàn)，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，差異逐漸顯著。 普通培養(yǎng)液組的肝細胞伸出的偽足數(shù)目較少，細胞多呈三 角形或梭形，細胞胞體較小，透光度差，且死細胞較多， 高倍鏡下觀察細胞胞漿內(nèi)有粗大的顆粒狀物質(zhì)，并且有大 量的空泡，細胞呈現(xiàn)代謝不良的狀態(tài)。培養(yǎng)5～7d后，貼壁 細胞出現(xiàn)回縮變形，胞核變得模糊，細胞逐漸趨于死亡。 而肝細胞培養(yǎng)液組在低倍鏡下觀察，培養(yǎng)瓶的背景干猙， 死細胞較少，貼壁細胞伸出多個偽足，呈多邊形。相鄰細 胞連接成小片狀。高倍鏡下觀察胞漿內(nèi)容物豐富，顆粒細 2 中文摘要 小均勻，細胞透光度好，胞核圓而且透亮。肝細胞培養(yǎng)液 組的細胞的生活狀態(tài)可以雛持在 10叫 之內(nèi)基本不發(fā)生 變化。隨著培養(yǎng)時間的延長，無論是普通培養(yǎng)液組還是肝 細胞培養(yǎng)液組的細胞均逐漸衰退死亡，或者出現(xiàn)其他的雜 質(zhì)細胞憂勢生長現(xiàn)象。整個培養(yǎng)過程中均未見到明顯的肝 細胞數(shù)目的增多。 結論：在培養(yǎng)液中添加轉鐵蛋白、牛胰島素、煙酚胺、 p－琉基乙醇以及促肝細胞生長因子，可以促進原代小鼠肝 細胞的貼壁生長，并且可以改善肝細胞在體外的代謝，使 之維持良好的生活狀態(tài)并且延長體外生存時間。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：R329.24

【參考文獻】

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2 朱薇,袁愛力,彭齊榮,賴卓勝,程天明;大鼠肝細胞的微載體黏附培養(yǎng)及其功能測定[J];中華器官移植雜志;2000年02期

3 孫綿方,蔡祝輝,施志清,馬風竹;一種新型的生物人工肝—微囊肝細胞[J];中國生物醫(yī)學工程學報;1989年04期

本文編號：2714209