【摘要】： 4-1BBL(CD137L)是Ⅱ型跨膜糖蛋白分子，TNF超家族成員，表達于各種活化的抗原提呈細胞(APC)表面，如：IFN-γ活化的巨噬細胞、CD40配體活化的B細胞、單核細胞、樹突狀細胞(DC)、T細胞、腫瘤細胞等。編碼人4-1BBL的基因位于19p13.3。其受體4-1BB(CD137)為TNF受體(TNFR)超家族成員，分子量為30KD的Ⅰ型跨膜糖蛋白表達于活化的CD4~+和CD8~+T細胞表面。編碼人4-1BB的基因位于1p36。4-1BB／4-1BBL介導的共刺激信號可以誘導T細胞的活化，增殖及抗凋亡作用，同時還可維持T細胞的長期生存及提高細胞因子的分泌。4-1BB／4-1BBL可以協(xié)同CD28／B7促進T細胞IL-2的分泌，4-1BBL亦可獨立于CD28傳遞共刺激信號聯(lián)合TCR信號參與T細胞的活化。CD28／B7主要在初次免疫應答中起作用而4-1BB／4-1BBL信號在初次免疫應答的后期，二次免疫應答及免疫記憶中發(fā)揮效應。有趣的是4-1BBL還可介導的逆向共刺激信號誘導單核細胞、腫瘤細胞的增殖及促進其細胞因子的分泌。這種逆向信號可能腫瘤免疫應答中可能起至關重要的作用。4-1BBL分子的激動劑或拮抗劑的研制及其在4-1BBL／4-1BB信號傳導調節(jié)作用的研究在腫瘤、移植排斥反應、自身免疫性疾病中具有重要的理論研究和應用價值。 1．本研究以人多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)細胞轉入4-1BBL基因細胞株XG1-4-1BBL為免疫原，免疫BALB／C小鼠，采用B淋巴細胞雜交瘤技術，將免疫后小鼠的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2／0進行細胞融合，以XG1-4-1BBL細胞株作 鼠抗人4，IBBL分子功能性單克隆抗體的研制及其生物學特性的研究 中文摘要 為陽性細胞株，以轉基因細胞的母本細胞XGI作為陰性對照細胞株，經免疫熒光標 記分析及抗體分泌陽性孔內細胞的反復篩選并經多次的克隆化培養(yǎng)，最終獲得1株 持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人4一IBBL單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為IFI。經快速定 性試紙分析法鑒定，它分泌的Ig類別為IgGI。經體外長期傳代培養(yǎng)和液氮凍存后復 蘇，雜交瘤細胞生長良好，分泌抗體的性能穩(wěn)定。 2.繼而采用本室建立的腹水誘生和純化方案，腹水形成的陽性率為95%，腹水的產 量平均為75mL/只小鼠。經ProteinG親和層析法純化抗體，純化后腹水mAb蛋白 的平均得率為3.50mg/mL。免疫熒光法分析表明，純化后腹水型單抗的效價為1:20()0 以上，純化后抗體蛋白用于間接免疫熒光分析的用量為0.25一2.0 09/1 xl護細胞。 3.為了研究單克隆抗體對4一IBBL分子表達細胞的識別和結合，選擇表達4一IBBL 膜分子的SUpT、Jurkat、HepGZ、Raji、Daudi、HL60、U266和新鮮分離的單核細 胞通過間接免疫熒光標記法及流式細胞儀(FCM)分析，結果顯示，單克隆抗體11:1 能特異性的識別不同細胞表達的4一IBBL分子。 4.進一步中和/阻斷實驗中表明，IFI能特異性阻斷rh4一IBBIj分子介導的協(xié)同刺激 信號，從而抑制rh4一IBBL聯(lián)合CD3激發(fā)型單抗對人外周血T淋巴細胞的增殖激發(fā) 效應。 5.經過3H一TdR摻入法、細胞記數、光鏡觀察及FCM分析證實IFI能介導逆向共 刺激信號促進表達4一BBL的人外周血來源的單核細胞增殖(3一9倍)，其作用明顯 強于th4一IBB對單核細胞促增殖效應。經IFI誘導擴增的單核細胞，經GM一CSF、IL一東 TNF一Q誘導培養(yǎng)后能分化發(fā)育成樹突狀細胞(DCs)初步分析證實該誘導的DCs不 論在表型還是在激發(fā)T細胞的功能較常規(guī)方法誘導的DCs無顯著差異。同時我們還 發(fā)現(xiàn)IFI也能促進DCs的增殖，提示IFI有可能成為一種更有效的體外培養(yǎng)大量單 核細胞及DCs的誘導劑，在腫瘤免疫治療中具有潛在的臨床應用價值。更令人感興 趣的是IFI能取代GM一CSF聯(lián)合IL一4誘導單核細胞分化發(fā)育成DCs。4一IBBL的信 號傳導通路及單核細胞、DCs的分化發(fā)育的機制至今尚不明確，值得進一步探討玄， 同時運用mAb IFI我們還發(fā)現(xiàn)，4一1 BBL分子特征性表達于呱、MS白血病新鮮標 本細胞上，而且mAb 1 Fll一10“留ml時，即可促進天然表達4一1 BBL分子的單核細 胞來源的腫瘤胞株HL60、SHI一1(MS型白血病細胞株)及MS白血病新鮮標本細胞 鼠抗人4一1 BBL分子功能性單克隆抗體的研制及其生物學特性的研究 中文摘要 生長，且這種對腫瘤細胞生長的促進作用隨培養(yǎng)時間及單克隆抗體濃度的增加而增 強。結果表明IFI在研究髓性白血病的生物學行為中具有重要的價值。 6，為了研究活化T細胞上4一IBBL的表達及其功能，采用常規(guī)方法成功研制了一株 抗人CD28分子的激發(fā)型單抗(1 0F3)。該單抗的亞類為IgGI，腹水形成的陽性率為 95%，腹水的產量平均為8.0 mL/只小鼠，純化后腹水mAb蛋白的平均得率為 7.0m留mL，抗體效價在1:5000以上。該單抗可聯(lián)合CD3激發(fā)型單抗活化人外周血 T細胞并促進其增殖(約5倍)。研究發(fā)現(xiàn)CD3+l 0F3活化的T細胞明顯上調4一IBBL 的表達。提示共表達于T細胞表面的4一IBBL和4一IBB可能參與了T細胞自身的調 節(jié)，其機制有待于進一步的探討。 綜上所述，本研究成功的研制成穩(wěn)定和特異分泌抗人4一IBBL及CD28的功能 性單克隆抗體的二株雜交瘤，首次證實所獲的抗人4一IBBL單克隆抗體(IFI)通過 逆向信號傳導，非常顯著地促進人外周血單核細胞的增殖，誘導單
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 邱玉華,張學光,季玉紅,居頌光,王廷;鼠抗人CD28分子單克隆抗體的研制及生物學特性研究[J];細胞與分子免疫學雜志;2001年04期

2 邱玉華，張學光，謝煒，朱學東;一種顯著提高小鼠生產單抗腹水產量的新方法[J];中國免疫學雜志;1995年06期

本文編號：2714512